Summary

Индукция гипоксии у живых лягушек и эмбрионов рыбок данио

Published: June 26, 2017
doi:

Summary

Мы вводим новую систему гипоксической камеры для использования с водными организмами, такими как эмбрионы лягушки и рыбок данио. Наша система проста, надежна, экономична и позволяет вводить и поддерживать гипоксию in vivo и до 48 часов. Мы представляем 2 воспроизводимых метода для мониторинга эффективности гипоксии.

Abstract

Здесь мы вводим новую систему индукции гипоксии, которую мы разработали для изучения эффектов гипоксии у водных организмов, таких как эмбрионы лягушки и рыбок данио. Наша система включает в себя камеру с простой установкой, которая тем не менее надежна, чтобы вызывать и поддерживать определенную концентрацию кислорода и температуру в любом выбранном экспериментальном решении. Представленная система является очень рентабельной, но очень функциональной, позволяет проводить индукцию и поддержание гипоксии для прямых экспериментов in vivo и в течение различных периодов времени до 48 часов.

Для мониторинга и изучения эффектов гипоксии мы использовали два метода – измерение уровней индуцируемого гипоксией фактора 1 альфа (HIF-1α) у целых эмбрионов или специфических тканей и определение пролиферации стволовых клеток сетчатки 5-этинил-2'- Дезоксиуридина (EdU) в ДНК. Уровни HIF-1α могут служить общим маркером гипоксии во всем эмбрионе или тканиВыбор, здесь эмбриональная сетчатка. Включение ЭДУ в пролиферирующие клетки эмбриональной сетчатки является специфическим результатом индукции гипоксии. Таким образом, мы показали, что гипоксические эмбриональные предшественники сетчатки снижают пролиферацию в течение 1 часа инкубации под 5% кислорода как эмбрионов лягушки, так и рыбок данио.

После освоения наша установка может использоваться для использования с небольшими организмами водных организмов, для прямых экспериментов in vivo , любого заданного периода времени и при нормальной, гипоксической или гипероксической концентрации кислорода или любой другой данной газовой смеси.

Introduction

Исследование Hypoxia имеет множество применений. К ним относятся исследование патогенеза и разработка методов лечения заболеваний, характеризующихся гипоксией 1 и острой больничной болезнью 2 . Гипоксический стресс вызывает значительные метаболические изменения во всех организмах, нуждающихся в кислороде. Гипоксический стресс также влияет на рост и развитие плода и патогенез нескольких заболеваний человека, включая ограничение внутриутробного роста 3 . Гипоксический стресс может не только приводить к снижению веса при рождении, плода и неонатальной смертности, но также может привести к многим осложнениям во взрослой жизни, таким как сердечно-сосудистые заболевания, диабет типа 2, ожирение и гипертония 4 . Гипоксический стресс также часто наблюдается при развитии солидной опухоли, когда опухолевая ткань перерастает в кровь. Поэтому важно иметь возможность изучать влияние гипоксии in vivo и непосредственно во время эмбриона Йонное развитие.

Среди наиболее известных методов, используемых для изучения эффектов гипоксии во время развития, является использование хлорида кобальта в среде роста или инкубация организма в гипоксической камере. Хлорид кобальта искусственно вызывает гипоксический ответ при нормальной концентрации кислорода из-за его роли в стабилизации гипоксически-индуцируемого фактора-1 альфа (HIF-1α), предотвращая его протеосомную деградацию 5 , 6 , 7 . Однако, являясь удобным методом 8 , использование хлорида кобальта, а также других аналогичных миметиков химической гипоксии может оказывать неспецифическое вредное воздействие на клетки и ткани, например , на апоптоз 9 . Поэтому гипоксические камеры являются лучшим методом индукции «естественной гипоксии» в живых организмах в процессе нормального развития.

Ntent "> Мы сосредоточились на разработке системы индукции гипоксии у эмбрионов водных животных. Как лягушки, так и рыбки данио теперь стали информативными модельными организмами-позвоночных для изучения многочисленных биологических процессов, а также моделей для различных заболеваний человека. Зародыши лягушек и рыбок данио Развиваются внешне, устраняя усложнение материнской компенсации. Кроме того, быстрый курс развития позволяет манипулировать факторами окружающей среды и наблюдать фенотипические изменения в формировании органов в реальном времени. Кроме того, многие компоненты основных путей передачи сигналов в значительной степени сохраняются в Эти модельные организмы и были подробно охарактеризованы большим объемом литературы. Главное преимущество использования лягушек и эмбрионов рыбок данио для изучения влияния гипоксии на развитие позвоночных заключается в том, что все процессы можно контролировать напрямую, так как кислород быстро проникает в эмбрионы. Таким образом, у лягушек и данио, как в отличие от других модельных организмов, таких какМышиные эмбрионы, влияние удельной концентрации кислорода можно исследовать в интересующей ткани, не принимая во внимание наличие или отсутствие функциональной сосудистой сети.

Большинство коммерчески доступных установок для гипоксической инкубации имеют недостаток в том, что они сравнительно большие и имеют соответственно высокие эксплуатационные расходы. Помимо высокой начальной стоимости и потребления газа, уравновешивание и поддержание общих гипоксических камер требует поддержания постоянной гипоксической атмосферы против газового градиента, который естественным образом возникает в этих камерах из-за их более крупного размера и / или дыхания организма. Это требует использования газовых вентиляторов и системы охлаждения, что увеличивает количество дополнительного необходимого оборудования, затрудняет ловкость исследователя и в целом снижает простоту экспериментальной процедуры. Напротив, установка, представленная здесь, является сравнительно надежной, но очень рентабельной, небольшой, простой в установке и позволяет fГазового равновесия, стабильной гипоксической атмосферы и простого обмена материалами и растворами внутри камеры. Наша система может использоваться для использования с любым интересующим организмом водной модели.

Мы построили гипоксическую камеру, которая удобно мала и поэтому может быть помещена в общий лабораторный инкубатор, что легко позволяет экспериментальные процедуры при любой определенной температуре. Обеспечивая удобное управление температурой, а также концентрацию кислорода в среде, преимущество нашей системы против коммерчески доступных инкубаторов гипоксии заключается в ее небольших размерах и экономической эффективности. Таким образом, наша установка может быть установлена ​​с использованием общих лабораторных материалов, доступных для большинства исследовательских лабораторий, и не требует каких-либо дорогостоящих материалов. Кроме того, наша установка не генерирует тепло, в отличие от коммерчески доступных инкубаторов гипоксии, и позволяет использовать при температурах ниже комнатной температуры, размещенных в инкубаторе. The laSt особенно важна для работы с хладнокровными организмами, такими как лягушки и рыба, где скорости развития и метаболизма сильно зависят от температуры.

Будучи очень экономичной и легко построенной, наша камера газового инкубатора, тем не менее, очень универсальна при установлении различных гипоксических или гипероксических условий, а также позволяет быстро и легко вводить различные среды и растворы для огромного количества экспериментальных условий. Кроме того, с использованием 24-луночного планшета вместо обычно используемых блюд или лабораторных резервуаров 10 , 11 , 12 наша система позволяет наблюдать и экспериментально обрабатывать несколько условий мутанта сразу.

Чтобы контролировать правильную индукцию гипоксии, мы контролировали уровни белка HIF-1α путем вестерн-блот-детектирования. Кроме того, количество пролиферирующих клеток до и после инкубацииN в гипоксической камере можно использовать для определения того, была ли индуцирована гипоксия в ткани. Этот метод основан на наших ранее опубликованных результатах 13 , свидетельствующих о том, что при индукции гипоксии снижается пролиферация в нише стволовых клеток эмбриональной сетчатки. Таким образом, мы контролировали уровень пролиферации стволовых клеток сетчатки путем добавления 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) к среде эмбриона и измерения его включения в ДНК вновь пролиферирующих клеток.

Protocol

Этот протокол следует рекомендациям по уходу за животными в Кембриджском университете. 1. Обслуживание животных Зародыши лягушки ПРИМЕЧАНИЕ. Эмбрионы можно поднимать и поддерживать в соответствии с животным и лабораторным оборудованием. Здесь описан пример об?…

Representative Results

Использование гипоксической камерной системы, которую мы здесь приводим, позволяет изучать эффекты гипоксии индивидуально и in vivo у всех живых животных. Гипоксию можно индуцировать путем размещения целых эмбрионов лягушки или рыбок данио в гипоксической камере …

Discussion

Здесь мы представили простой, но прочный новый метод для индуцирования гипоксии, который приспособлен для использования с эмбрионами лягушки и данио, но может также быть подходящим для других водных организмов. Основным преимуществом этого метода является его простота и экономичност…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана поддержкой от Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z до WAH и стипендией DFG KH 376 / 1-1, присужденной HK

Materials

Sodium chloride Sigma S7653 NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST
Potassium chloride Sigma P9333 KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu,
Sodium bicarbonate Sigma S5761 NaHCO3 / 0.1X MBS
HEPES Sigma H3375 0.1X MBS
Magnesium sulfate Sigma M7506 MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium
Calcium nitrate Sigma 202967 Ca (NO3)2 / 0.1X MBS
Calcium chloride Sigma C1016 CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium
Methylene blue Sigma M9140 Embryo medium
Pregnant mare serum gonadotropin Sigma CG10 frog fertilization
Zebrafish breeding tank Carolina 161937 gas chamber construction
24-well plate Thermo Scientific 142475 Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction
Epoxy resin RS Components UK Kit 199-1468
Gas distributor valve WPI Luer Valves Kit 14011 aquatic tank attachment (Schema 1, H)
High precision gas valve BOC  200 bar HiQ C106X/2B gas tank attachment (Schema 1, I)
5% oxygen and 95% N2 gas tank BOC 226686-L hypoxic gas mixture
ceramic disc diffuser CO2 Art  Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 Schema 1, J
silicone grease Scientific Laboratory Supplies VAC1100 Schema 1, K
oxymeter Oxford Optronix  Oxylite, CP/022/001 hypoxic chamber setup
fibre-optic dissolved oxygen sensor Oxford Optronix HL_BF/OT/E hypoxic chamber setup
plastic pasteur pipette Sterilin STS3855604D for embryo transfer
MS222  Sigma Aldrich E10521-50G embryo anesthetic
RIPA buffer  Sigma R0278-50ML tissue homogenization
Protease inhibitor Sigma P8340 tissue homogenization
Tris Sigma 77-86-1 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST
Glycerol Sigma G5516 4X Laemmli loading buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma L3771 SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer
beta-Mercaptoethanol  Sigma M6250 4X Laemmli loading buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 4X Laemmli loading buffer
Trizma base  Sigma 77-86-1 5X Running buffer, Transfer buffer
Glycine Sigma G8898 5X Running buffer, Transfer buffer
Methanol Sigma 34860 Transfer buffer
Tween 20 Sigma P2287-500ML 10X TBST
skim milk powder Sigma 70166 Blocking Solution
Eppendorf microcentrifuge tube Sigma T9661
tissue homogenizer Pellet Pestle Motor Kontes Z359971 tissue homogenization
pellet pestles Sigma Z359947-100EA tissue homogenization
precast 12% gel Biorad Mini-ProteinTGX, 456-1043 Western Blot
protein ladder Amersham Full-Range Rainbow ladder, RPN800E Western Blot
nitrocellulose membrane (0.45 µm) Biorad 162-0115 Western Blot
anti-HIF-1α antibody Abcam ab2185 Western Blot
anti-α-tubulin antibody Sigma T6074 Western Blot
goat anti-rabbit antibody Abcam ab6789 Western Blot
goat anti-mouse antibody Abcam ab97080 Western Blot
Pierce ECL 2 reagent  Thermo Scientific 80196 Western Blot
ECL films Hyperfilm GE Healthcare Amersham 28906837 Western Blot
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine   santa cruz CAS 61135-33-9 EdU, EdU incorporation
Phosphate-buffered Saline Oxoid BR0014G 1X PBS
Formaldehyde Thermo Scientific 28908 Fixation solution
Sucrose Fluka S/8600/60 Solution solution
Triton X-100 Sigma T9284-500ML PBST
Heat-inactivated Goat Serum Sigma G6767-100ml HIGS, Blocking solution (EdU incorporation)
4',6-diamidino-2-phenylindole  ThermoFisher Scientific D1306 DAPI, EdU incorporation
Dimethyl sulfoxide Molecular Probes C10338 DMSO, EdU incorporation
glass vial VWR 98178853 EdU incorporation analysis
Tissue-Plus optimal cutting temperature compound  Scigen 4563 embedding medium, EdU incorporation analysis
cryostat Jung Fridgocut 2800E Leica  CM3035S EdU incorporation analysis
microscope slides Super-Frost plus Menzel glass Thermo Scientific J1800AMNZ EdU incorporation analysis
EdU Click-iT chemistry kit Molecular Probes C10338 EdU incorporation analysis
FluorSave Calbiochem D00170200 mounting medium, EdU incorporation analysis
coverslips VWR ECN631-1575 EdU incorporation analysis
fluorescent microscope Nikon Eclipse 80i EdU incorporation analysis
confocal scanning microscope Olympus Fluoview FV1000 EdU incorporation analysis
Volocity software PerkinElmer Volocity 6.3 EdU incorporation analysis

References

  1. Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
  2. Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude?. Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
  3. Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
  4. Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
  5. Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
  6. Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
  7. Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
  8. Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
  9. Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
  10. Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
  11. Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
  12. Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).
  13. Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
  14. Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, D. P., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
  15. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  16. Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. . Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
  17. McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).

Play Video

Citer Cet Article
Khaliullina-Skultety, H., Zi Chao, N., Harris, W. A. Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (124), e55710, doi:10.3791/55710 (2017).

View Video