Induzione di ipossia in rana vivente e embryos zebrafish

La ricerca di ipossia ha numerose applicazioni. Questi includono indagare la patogenesi e sviluppare trattamenti per le condizioni mediche caratterizzate da ipossia ¹ e malattia acuta di alta altitudine ² . Lo stress ipossico provoca importanti cambiamenti metabolici in tutti gli organismi che richiedono ossigeno. Lo stress ipossico influenza anche la crescita fetale e lo sviluppo e la patogenesi di diverse malattie umane, inclusa la restrizione intrauterina della crescita ³ . Lo stress ipossico non può solo portare a ridurre il peso alla nascita, la mortalità fetale e neonatale, ma può anche provocare molte complicazioni nella vita adulta, come la malattia cardiovascolare, il diabete di tipo 2, l'obesità e l'ipertensione ⁴ . Lo stress ipossico è spesso osservato durante lo sviluppo del tumore solido, quando il tessuto tumorale supera la sua offerta di sangue. È quindi fondamentale poter studiare gli effetti dell'ipossia in vivo e direttamente durante l'embr Lo sviluppo yonic.

Tra i metodi più noti che sono stati utilizzati per studiare gli effetti dell'ipossia durante lo sviluppo è l'impiego di cloruro di cobalto nel mezzo di crescita o l'incubazione dell'organismo in una camera ipossica. La cloruro di cobalto induce artificialmente una reazione ipossidica alla normale concentrazione di ossigeno, a causa del suo ruolo nella stabilizzazione di alfa (HIF-1α) di fattore-1 indotta da ipossia, impedendo il degrado proteosomico ^{5 , 6 , 7} . Tuttavia, essendo un metodo conveniente ⁸ , l'uso di cloruro di cobalto e altri simili mimetici di ipossia chimica possono avere effetti deleteri non specifici sulle cellule e sui tessuti, ad esempio l' apoptosi ⁹ . Di conseguenza, le camere ipossiche sono un metodo migliore per l'induzione di "ipossia naturale" negli organismi viventi attraverso il corso di uno sviluppo normale.

Ntent "> Ci siamo concentrati sullo sviluppo di un sistema per l'induzione di ipossia negli embrioni animali acquatici, sia le rane che gli zebrafish che sono diventati degli organismi modello vertebrati informativi per studi di numerosi processi biologici, nonché modelli per varie malattie umane. Sviluppare ulteriormente, eliminando la complicazione della compensazione materna Inoltre, un rapido sviluppo dello sviluppo consente di manipolare i fattori ambientali e di osservare i cambiamenti fenotipici nella formazione degli organi in tempo reale. Inoltre, molti componenti dei principali percorsi di trasduzione del segnale sono altamente conservati Questi organismi di modello sono stati caratterizzati in dettaglio da un ampio volume di letteratura. Il principale vantaggio nell'uso delle rane e degli embrioni di zebrafish per studiare gli effetti dell'ipossia sullo sviluppo del vertebrato è che tutti i processi possono essere monitorati direttamente, in quanto l'ossigeno penetra rapidamente negli embrioni. Così, in rane e zebrafish, come in contrasto con altri organismi di modello comeEmbrioni di topi, l'influenza di una specifica concentrazione di ossigeno può essere studiata nel tessuto di interesse, senza prendere in considerazione la presenza o la mancanza di vascolarizzazione funzionale.

La maggior parte delle configurazioni commercialmente disponibili per l'incubazione ipossica presenta lo svantaggio di essere comparabilmente grandi e avendo così elevati costi di funzionamento. Oltre al loro elevato costo iniziale e al consumo di gas, l'equilibratura e la manutenzione di camere comuni di ipossia richiedono l'assunzione di un'atmosfera ipossica costante contro il gradiente del gas che si verifica naturalmente in queste camere a causa della loro dimensione e / o respiratorio dell'organismo. Ciò richiede l'impiego di ventilatori a gas e di un sistema di raffreddamento, che aumenta la quantità di apparecchiature necessarie aggiuntive, ostacola la destrezza del ricercatore e in generale diminuisce la semplicità della procedura sperimentale. Al contrario, l'installazione che presentiamo qui è comparabilmente robusta ma molto conveniente, piccola, facile da stabilire e permette fL'equilibratura del gas, l'atmosfera ipossica stabile e lo scambio semplice di materiali e soluzioni all'interno della camera. Il nostro sistema può essere utilizzato per l'utilizzo con qualsiasi organismo di interesse acquatico.

Abbiamo costruito una camera ipossica che è convenientemente piccola e quindi può essere collocata all'interno di un incubatore di laboratorio comune, che consente facilmente le procedure sperimentali a qualsiasi temperatura specifica. Fornire un comodo controllo della temperatura e la concentrazione di ossigeno nel mezzo, il vantaggio del nostro sistema contro gli incubatori di ipossia commercialmente disponibili risiede nella sua ridotta dimensione e nell'efficienza dei costi. Quindi, la nostra configurazione può essere creata usando le forniture di laboratorio disponibili per la maggior parte dei laboratori di ricerca e non richiedono materiali costosi. Inoltre, la nostra configurazione non genera calore, a differenza degli incubatori di ipossia commercialmente disponibili e consente l'utilizzo a temperature inferiori alla temperatura ambiente in un incubatore. La laSt è particolarmente importante per il lavoro con organismi sangue freddi come rane e pesci dove i tassi di sviluppo e metabolismo sono fortemente dipendenti dalla temperatura.

Essendo molto conveniente e facilmente costruito, la nostra camera di incubazione del gas è tuttavia molto versatile nella determinazione di diverse condizioni ipossiche o iperossiche, oltre a consentire una gestione rapida e facile di diversi supporti e soluzioni per un vasto numero di condizioni sperimentali. Inoltre, impiegando una piastra a 24 pozzetti invece di piatti comunemente usati o serbatoi di laboratorio ^{10 , 11 , 12} , il nostro sistema consente di osservare e sperimentare contemporaneamente diverse condizioni mutanti.

Per controllare la corretta induzione dell'ipossia, abbiamo monitorato i livelli della proteina HIF-1α mediante la rilevazione Western blot. Inoltre, il numero di cellule proliferanti prima e dopo l'incubazioneN nella camera ipossica può essere utilizzato per determinare se l'ipossia è stata indotta nel tessuto. Questo metodo si basa sui nostri risultati pubblicati in precedenza ¹³ , mostrando che la proliferazione nella nicchia delle cellule staminali del retino embrionale diminuisce dopo l'induzione dell'ipossia. Così abbiamo monitorato il livello della proliferazione delle cellule staminali retiniche aggiungendo l'5-etinil-2'-deoxyuridine (EdU) al mezzo embrionale e misurando la sua incorporazione nel DNA delle cellule appena proliferanti.