近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

DNA損傷は、タンパク質 – タンパク質相互作用、およびDNAの効率的かつ迅速な修復を確実にする翻訳後修飾を含む高度に制御された一連の事象を誘発し、それによってゲノムの完全性^{1を保護する} 。典型的には、DNA修復は、（共焦点）蛍光顕微鏡法によるいわゆる電離放射線誘導病巣（IRIF）の形成をモニターすることによって電離放射線に曝露された細胞において研究される。多くのDNA修復およびDNA損傷感知タンパク質はIRIFを形成し、これはDNA損傷を維持するクロマチン部位で核形成するタンパク質複合体を表す^2,3 。時間の経過とともにIRIFの位置と解像度は、DNA修復の時空間的組織化に重要な洞察を与え、異なるDNA修復経路の関与を示している可能性がある。損傷が達成されたDNA損傷および細胞周期段階の性質は、どのDNA修復経路が活性化されるかを決定する。フォ DNA複製（S期）に活発に関与する細胞では、相同組換え（HR）が優性のDNA修復経路であるのに対し、細胞周期のG1期またはG2 / M期の細胞では、相同末端結合（NHEJ）修復経路が優勢である。 DNA損傷後の最も初期の事象の1つは、細胞周期のG1-およびG2 / M-相において大部分が活性であり、NHEJを調節するDNA損傷感知キナーゼAtaxia毛細血管拡張突然変異タンパク質（ATM）の活性化であり、 HRを活性化することによってS期に作用するRad3関連タンパク質（ATR）を含むが、これらに限定されない。 ATMとATRの両方は、DNA修復、細胞死および生存に関与する多くのタンパク質をリン酸化する非常に多面的なキナーゼである⁴ 。両方のキナーゼは、遺伝毒性ストレスに曝された後に腫瘍抑制タンパク質p53をリン酸化して活性化することが示されており、これらのキナーゼは、重要な腫瘍抑制シグナル伝達軸の上流メディエーターであることが示されている"xref"> 5,6。

IRIFの形成および組成は、典型的には、2色免疫蛍光染色および顕微鏡法を用いて異なるタンパク質の共局在を決定することによって評価されるが、修復タンパク質複合体の一部であるタンパク質のすべてがIRIFを形成するわけではない。さらに、（共焦点）免疫蛍光顕微鏡法は、光の回折特性によって制限され、約200〜300nmの空間分解能がかなり低く、ほとんどの細胞内構造のサイズを超えており、本質的にタンパク質 – タンパク質相互作用分子レベル。このように、（共焦点）蛍光顕微鏡によって検出される免疫蛍光染色パターンの共局在化は、必ずしも直接的なタンパク質 – タンパク質相互作用を示すものではない。最近、3次元構造物のような新しい超解像技術が開発されている共焦点レーザー走査顕微鏡^8で検出できなかったこれらのタンパク質の空間分布特性を明らかにする、ナノスケールの詳細における53BP1およびBRCA1 IRIF形成の研究に首尾よく使用された、テューティング照明顕微鏡（3D-SIM） ⁷ 。

イン・ビボでのタンパク質 – タンパク質相互作用、例えば共免疫沈降法、プルダウン法および酵母ツーハイブリッドスクリーニング法を検出するために、いくつかの他の方法を使用することができる。しかしながら、これらの技術はかなり煩雑であり、多量の細胞またはタンパク質を必要とするか、またはタンパク質の過剰発現を伴い、実験的人工物を導入する。最近では、Proximity Ligation Assay（PLA） ^9,10と呼ばれるin-situ （ すなわち 、細胞および組織における）タンパク質 – タンパク質相互作用の視覚化および定量化を可能にする新規な技術が開発されている。 Pr関心対象の2つのタンパク質を認識する二価抗体は、オリゴヌクレオチド（いわゆるPLAプローブ）にコンジュゲートされた二次抗体によって検出される。 2つの異なる二次抗体が、一次抗体によって認識されるタンパク質間の相互作用のために十分に接近している場合、結合オリゴヌクレオチドはハイブリダイズし、ライゲーションして閉環状DNA基質を形成することができる。この環状基質は続いてローリングサークル増幅により増幅され、蛍光色素と結合した相補的オリゴヌクレオチドで視覚化される。 PLAを使用すると、蛍光標識されたローリングサークル増幅産物がPLAプローブに付着したままであるので、タンパク質 – タンパク質相互作用の細胞内局在が保存される。このアッセイの分解能は、抗体の直径が約7〜10nmであるという知見に基づいて<50nmである¹¹ 。ローリングサークル増幅は、2対の抗体（プライマリ+セコンdary）は、そのサイズ（10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm）で定義される周囲内で物理的に相互作用します。シグナル増幅工程は、PLAアッセイの感度を高め、ほとんど発現しないタンパク質の相互作用の検出を可能にする。 PLAは、細胞間単位で定量することができる点状の病巣様シグナルパターンを生成し、それによってタンパク質 – タンパク質相互作用における細胞内および細胞間の変動を評価することができる。

DNA修復複合体およびIRIFの形成および組成は、ヒト骨肉腫上皮細胞株U2OS、ヒト胎児腎細胞株HEK293および網膜色素上皮細胞株RPE-1のような接着細胞株で研究されており、増殖し、トランスフェクションしやすい。これらのリンパ系細胞系および骨髄系細胞系のような懸濁細胞培養は、トランスフェクションの影響を受けにくく、一般的にカバーガラスに付着しないため、使用頻度が低いイメージングのためのeps。しかし、DNA損傷応答は、これらの腫瘍におけるゲノム（ドライバー）異常によって頻繁に影響され、正常なリンパ系および骨髄系の悪性形質転換において中心的な役割を果たすため、リンパ系および骨髄系の悪性疾患の状況において、前駆細胞）細胞^12,13,14 。

このプロトコールは、浮遊細胞培養におけるDNA損傷の誘導後にPLAがどのようにしてタンパク質 – タンパク質相互作用を評価および定量するために使用され得るかを記載する。ここで、PLAは、G1期の細胞周期停止を受けるように誘導されたヒトB細胞白血病細胞におけるDNA損傷に対するATMとp53との間の相互作用を決定し可視化するために行われる。注目すべきは、ここに提示されたプロトコルは、G1拘束性白血病細胞におけるATMおよびp53相互作用の研究に限定されないが、他のタンパク質 – タンパク質相互作用を視覚化するために使用することもできる種々の細胞型および懸濁細胞培養における細胞の増殖を阻害する。