Détection et visualisation des complexes protéiques induits par endommagement de l'ADN dans des cultures cellulaires en suspension utilisant l'essai de ligature de proximité

Le dégât de l'ADN déclenche une série d'événements hautement réglementés impliquant des interactions protéine-protéine et des modifications post-traductionnelles qui garantissent une réparation efficace et rapide de l'ADN, protégeant ainsi l'intégrité génomique ¹ . Typiquement, la réparation de l'ADN est étudiée dans des cellules exposées aux rayonnements ionisants en surveillant la formation de soi-disant foyers induits par rayonnement ionisant (IRIF) par microscopie de fluorescence (confocale). De nombreuses protéines de détection de l'ADN et de détection des dommages à l'ADN forment des IRIF, qui représentent des complexes de protéines qui se nucléent sur des sites de chromatine endommagés par l'ADN ^{2 , 3} . L'emplacement et la résolution des IRIF au fil du temps donnent un aperçu important de l'organisation spatio-temporelle de la réparation de l'ADN et peuvent indiquer l'implication de différentes voies de réparation de l'ADN. La nature de l'endommagement de l'ADN et l'étape du cycle cellulaire dans laquelle le dommage est atteint déterminent la voie de réparation de l'ADN activée. Fo Par exemple, dans les cellules activement engagées dans la replication de l'ADN (phase S), la recombinaison homologue (HR) est la voie de réparation de l'ADN dominante, alors que dans les cellules de la phase G1 ou G2 / M du cycle cellulaire, La voie de réparation homologue de jointure finale (NHEJ) prédomine. L'activation des kinases sensibles aux dommages à l'ADN Ataxia Telangiectasia-Mutated protein (ATM), qui est principalement active dans les phases G1 et G2 / M du cycle cellulaire et régule le NHEJ, Et Ataxia Telangiectasia et protéines liées à Rad3 (ATR), qui agit en phase S en activant des ressources humaines. L'ATM et l'ATR sont des kinases très pleiotropes qui phosphorylent de nombreuses protéines impliquées dans la réparation de l'ADN, la mort cellulaire et la survie ⁴ . Les deux kinases se sont révélées phosphoryler et activer la protéine suppresseur de tumeur p53 après l'exposition au stress génotoxique, ce qui indique que ces kinases sont des médiateurs en amont d'un axe de signalisation suppresseur de tumeur pivot"Xref"> 5 ^{, 6} .

La formation et la composition des IRIF sont généralement évaluées en déterminant la co-localisation de différentes protéines en utilisant une coloration et une microscopie à double couleur d'immunofluorescence, mais toutes les protéines qui font partie des complexes de protéines de réparation forment IRIF, ce qui limite l'applicabilité de cette approche. Par ailleurs, la microscopie d'immunofluorescence (confocal) est limitée par les propriétés de diffraction de la lumière, ce qui entraîne une résolution spatiale assez faible d'environ 200 à 300 nm, dépassant la taille de la plupart des structures subcellulaires, ce qui interdit essentiellement l'interrogation directe des interactions protéine-protéine au Le niveau moléculaire. En tant que tel, la co-localisation des motifs de coloration par immunofluorescence détectés par microscopie de fluorescence (confocale) n'est pas nécessairement indicative d'interactions directes protéines-protéines. Récemment, de nouvelles technologies de super résolution ont été développées, telles que la structure tridimensionnelle(3D-SIM) ⁷ , qui a été utilisé avec succès pour étudier la formation d'IRIF 53BP1 et BRCA1 à des détails à l'échelle nanométrique, révélant les caractéristiques de distribution spatiale de ces protéines qui n'ont pas été détectées par microscopie confocale à balayage laser ⁸ .

Plusieurs autres méthodes peuvent être utilisées pour détecter les interactions protéine-protéine in vivo , telles que la co-immunoprécipitation, les méthodes d'extraction et les approches de dépistage à deux hybrides de levure. Cependant, ces techniques sont plutôt encombrantes, nécessitent de grandes quantités de cellules ou de protéines ou impliquent une surexpression de protéines, qui introduit des artefacts expérimentaux. Plus récemment, une nouvelle technique a été développée qui permet la visualisation et la quantification des interactions protéine-protéine in situ ( c.- à -d. Dans les cellules et dans les tissus), appelée Ensemble de ligature de proximité (PLA) ^{9 , 10} . PrLes anticorps généraux qui reconnaissent deux protéines d'intérêt sont détectés par des anticorps secondaires conjugués aux oligonucléotides (appelés sondes PLA). Si les deux anticorps secondaires différents sont suffisamment proches en raison des interactions entre les protéines reconnues par les anticorps primaires, les oligonucléotides conjugués s'hybrident et peuvent être ligaturés pour former un substrat d'ADN circulaire fermé. Ce substrat circulaire est ensuite amplifié par amplification du cercle roulant et visualisé avec des oligonucleotides complémentaires conjugués au fluorochrome. En utilisant PLA, la localisation subcellulaire de l'interaction protéine-protéine est préservée lorsque le produit d'amplification du cercle roulant marqué par fluorescence reste attaché aux sondes PLA. La résolution de ce dosage est <50 nm, en fonction de la constatation que le diamètre d'un anticorps est d'environ 7 à 10 nm ¹¹ . L'amplification du cercle circulant ne peut avoir lieu que dans le cas où deux paires d'anticorps (primaire + seconDary) interagissent physiquement dans le périmètre qui est défini par leur taille (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). L'étape d'amplification du signal augmente la sensibilité du test PLA et permet de détecter les interactions de protéines à peine exprimées. La PLA génère des signes de signaux ponctuels et axiaux qui peuvent être quantifiés par cellule, par lesquels la variation intra-et inter-cellulaire des interactions protéine-protéine peut être évaluée.

La formation et la composition des complexes de réparation de l'ADN et des IRIF sont principalement étudiées dans des lignées cellulaires adhérentes telles que la lignée cellulaire épithéliale osseosarcome du os humain U2OS, la lignée cellulaire rénale embryonnaire humaine HEK293 et ​​la lignée cellulaire épithéliale du pigment rétinien RPE-1, Croissant et facile à transfecter. Des cultures de cellules de suspension telles que des lignées lymphoïdes et des liaisons myéloïdes sont utilisées moins fréquemment, étant donné qu'elles sont moins susceptibles d'être transfectées et, en général, elles ne respectent pas les lamelles, nécessitant ainsi une alternative supplémentaireEps pour l'imagerie. La résolution des dommages à l'ADN est cependant très pertinente dans le contexte des tumeurs malignes lymphoïdes et myéloïdes, car la réponse aux dommages à l'ADN est fréquemment affectée par des aberrations génomiques (conducteurs) dans ces tumeurs, jouant un rôle central dans la transformation maligne du lymphoïde et de la myéloïde normaux ( Cellules progénitrices ^{12 , 13 , 14} .

Ce protocole décrit comment l'APL peut être utilisé pour évaluer et quantifier les interactions protéine-protéine suite à l'induction d'un endommagement de l'ADN dans des cultures cellulaires en suspension. Ici, le PLA est réalisé pour déterminer et visualiser les interactions entre ATM et p53 lors d'un endommagement de l'ADN dans des cellules de leucémie à cellules B humaines qui sont induites à subir une arrêt du cycle cellulaire en phase G1. Il est à noter que le protocole présenté ici ne se limite pas à l'étude des interactions ATM et p53 dans les cellules de leucémie arrêtées par G1, mais peut également être utilisé pour visualiser d'autres interactions protéines-protéinesDans divers types de cellules et cultures cellulaires en suspension.