Summary

Expressão de Proteína Recombinante, Cristalização e Estudos Biofísicos de<em> Bacillus</em> -conservado Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Published: May 16, 2017
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Summary

Bacillus anthracis é o agente patogénico obrigatório do antraz mortal por inalação, pelo que os estudos dos seus genes e proteínas são rigorosamente regulados. Uma abordagem alternativa é estudar genes ortólogos. Descrevemos estudos biofísico-químicos de um ortólogo de B. anthracis em B. cereus , bc1531, requerendo equipamento experimental mínimo e sem preocupações de segurança graves.

Abstract

Para superar as restrições e regulamentações de segurança ao estudar genes e proteínas de patógenos verdadeiros, seus homólogos podem ser estudados. Bacillus anthracis é um agente patogénico obrigatório que provoca o antraz mortal por inalação. Bacillus cereus é considerado um modelo útil para estudar B. anthracis devido à sua estreita relação evolutiva. O grupo de genes ba1554ba1558 de B. anthracis é altamente conservado com o cluster bc1531bc1535 em B. cereus , bem como com o cluster bt1364 – bt1368 em Bacillus thuringiensis, indicando o papel crítico dos genes associados no gênero Bacillus . Este manuscrito descreve métodos para preparar e caracterizar um produto proteico do primeiro gene ( ba1554 ) do grupo genético em B. anthracis usando uma proteína recombinante de seu ortholog em B. cereus , bc1531.

Introduction

A expressão de proteína recombinante é amplamente utilizada para superar problemas associados a fontes de proteína naturais, tais como quantidades limitadas de proteínas e contaminação prejudicial. Além disso, nos estudos de genes patogénicos e proteínas, uma estirpe laboratorial alternativa que não requer precauções adicionais de segurança pode ser utilizada. Por exemplo, Bacillus cereus é um modelo útil para estudar Bacillus anthracis devido à sua estreita relação evolutiva 1 .

B. anthracis é um agente patogénico obrigatório que provoca o antraz mortal por inalação em seres humanos e gado e pode potencialmente ser utilizado como arma biológica 2 . Assim, os estudos laboratoriais sobre B. anthracis são rigorosamente regulados pelos Centros de Controle de Doenças dos Estados Unidos, exigindo práticas de nível 3 de biossegurança (BSL-3), que determinam que a área do laboratório seja segregada com pressão negativa. Em contraste com B. anthracis </eM>, B. cereus é categorizado como um agente BSL-1 e, portanto, tem preocupações mínimas de segurança. B. cereus é um patógeno oportunista que, após a infecção, provoca intoxicação alimentar que pode ser tratada sem assistência médica. No entanto, uma vez que B. cereus partilha muitos genes críticos com B. anthracis , as funções das proteínas de B. anthracis podem ser estudadas utilizando os correspondentes homólogos de B. cereus 1 .

O agrupamento de genes ba1554ba1558 de B. anthracis é altamente conservado com o agrupamento bc1531bc1535 De B. cereus , bem como com o grupo bt1364-bt1368 de Bacillus thuringiensis , em termos de organização e sequência de genes. Além disso, os primeiros genes ( ba1554 , bc1531 e bt1364 ) dos respectivos clusters são absolutamente conservados ( isto é, 100% de identidade de sequência de nucleótidos), implyiUm papel crítico do produto gênico nas espécies de Bacillus . Devido à sua localização nestes agrupamentos de genes, ba1554 foi mal identificado como um suposto transcrição regulador [ 3] . No entanto, a análise da sequência de aminoácidos do produto ba1554 indica que pertence à família MazG, que tem actividade de nucleótido pirofosfoidrolase e não está associada à actividade do factor de transcrição 4 , 5 . Embora as proteínas pertencentes à família MazG sejam diversas em relação à sequência e ao comprimento globais, partilham um domínio MazG comum de ~ 100 resíduos caracterizado por um motivo EXXE 12-28 EXXD ("X" significa qualquer resíduo de aminoácido e o número Indica o número de resíduos X).

O domínio MazG nem sempre representa diretamente uma determinada atividade catalítica. Um membro MazG de Escherichia coli (EcMazG) possui dois domínios MazG, mas emO domínio MazG C-terminal é enzimaticamente activo 6 . Além disso, a especificidade do substrato de enzimas MazG varia de nucleosídeos trifosfatos não específicos (para EcMazG) para dCTP / dATP específicos (para integrados MazG) e dUTP (para dUTPases) 6 , 7 , 8 , 9 . Por conseguinte, são necessárias análises biofísicoquímicas da proteína BA1554 para confirmar a sua actividade NTPase e para decifrar a sua especificidade de substrato.

Aqui, fornecemos um protocolo passo a passo que a maioria dos laboratórios sem uma instalação BSL-3 pode seguir para caracterizar o produto proteico do gene B. cereus bc1531 , que é um ortholog de B. anthracis ba1554 , a nível molecular. Resumidamente, BC1531 recombinante (rBC1531) foi expresso em E. coli e purificado utilizando um marcador de afinidade. Para experimentos cristalográficos de raios X,Zação da proteína rBC1531 foram selecionadas e otimizadas. Para avaliar a actividade enzimática de rBC1531, a actividade de NTPase foi monitorizada colorimetricamente para evitar nucleótidos marcados radioactivamente que foram convencionalmente utilizados. Finalmente, as análises dos dados biofísico-químicos obtidos nos permitiram determinar o estado de oligomerização e os parâmetros catalíticos de rBC1531, bem como obter dados de difração de raios X a partir do cristal rBC1531.

Protocol

1. Produção e Purificação de Proteína Recombinante de rBC1531 Prepara�o de um plasm�eo de express� da prote�a BC1531 recombinante (rBC1531) Preparar DNA genômico de B. cereus 10 . Amplificar o gene bc1531 a partir de um molde de ADN genómico de B. cereus por reacção em cadeia com polimerase (PCR), utilizando iniciadores directos e inversos (ver a Lista de Materiais) para criar locais de…

Representative Results

A caracterização da proteína de interesse neste estudo começou por preparar uma quantidade suficiente de proteína Bc1531 (rBC1531) recombinante de B. cereus , de preferência mais do que vários miligramas. O fragmento de ADN que codifica a proteína BC1531 foi preparado por PCR utilizando o ADN genómico de B. cereus como molde, uma vez que contém genes ortólogos idênticos a ba1554 . RBC1531 foi sobre-expresso como uma proteína solúvel em c?…

Discussion

Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving fr…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os conjuntos de dados de difracção de raios X foram recolhidos na linha 7A do Laboratório de Aceleração de Pohang (Coreia). Este estudo foi apoiado pelo Programa de Investigação Científica Básica administrado através da Fundação Nacional de Investigação da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência, TIC e Planeamento do Futuro (2015R1A1A01057574 a MH).

Materials

Bacillus cereus ATCC14579 Korean Collection for Tissue Culture 3624
Genomic DNA prep kit GeneAll 106-101 Genomic DNA preparation
Forward primer Macrogen GAAGGATCCGGAAGCAAAAA
CGATGAAAGATATGCA
BamHI site is underlined
Reverse primer Macrogen CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT
CCCTCATCAATACGTG
SalI site is underlined
nPfu-Forte Enzynomics P410 PCR polymerase
BamHI Enzynomics R003S
SalI Enzynomics R009S
pET49b expression vector Novagen 71463 Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites10
T4 DNA ligase Enzynomics M001S
Dialysis memebrane Thermofisher 18265017
Dry block heater JSR JSBL-02T
LB broth (Luria-Bertani) LPS solution LB-05
LB Agar, Miller (Luria-Bertani) Becton, Dickinson and Company
Kanamycin LPS solution KAN025
Mini-prep kit Favorgen FAPDE300 Plasmid DNA preparation
BL21(DE3) Competent cell Novagen 69450-3CN
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Fisher BioReagents 50-213-378
Sodium chloride Daejung 7548-4100 PBS material
Potassium chloride Daejung 6566-4405 PBS material
Potassium phosphate Bio Basic Inc PB0445 PBS material
Sodium phosphate Bio Basic Inc S0404 PBS material
Imidazole Bio Basic Inc IB0277
Sonicator Sonics VCX 130
Ni-NTA agaros Qiagen 30210 Nickel bead
Rotator Finepcr AG
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-rad 1610374 SDS-PAGE protein standard
Coonmassie Brilliant Blue R-250 Fisher BioReagents BP101-25 Coomassie staining solution
Methyl alcohol Samchun chemical M0585 Coomassie staining solution
Acetic acid Daejung 1002-4105 Coomassie staining solution
Dialysis memebrane Thermofisher 68035
2-Mercaptoethanol Sigma-aldrich M6250
Thrombin Merckmillipore 605157-1KUCN Prepare aliquots of 20 μl (1 Unit per μl) and store at 70 °C and thaw before use
Superdex 200 16/600 General Electric 28989335 Size exclusion chromatography
Gel filtration standard Bio-rad 151-1901
Centrifugal filter Amicon UFC800396
Crystralization plates Hampton research HR3-083 96-well sitting drop plate
The JCSG core suite I-IV Qiagen 130924-130927 Crystallization secreening solution
Microscope Nikon SMZ745T
Cryschem plates Hampton research HR3-158 24-well sitting drop plate
Inorganic pyrophosphatase Sigma 10108987001
Ammonium molybdate solution Sigma 13106-76-8
L-ascorbic acid Sigma 50-81-7
NTP substrate Startagene 200415-51
Spectrophotometer Biotek SynergyH1 microplate reader
GraphPad Prism 5 GraphPad Prism 5 for Window

References

  1. Ivanova, N., et al. Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis. Nature. 423, 87-91 (2003).
  2. Spencer, R. C. Bacillus anthracis. J Clin Pathol. 56, 182-187 (2003).
  3. Deli, A., et al. LmbE proteins from Bacillus cereus are de-N-acetylases with broad substrate specificity and are highly similar to proteins in Bacillus anthracis. FEBS J. 277, 2740-2753 (2010).
  4. Gross, M., Marianovsky, I., Glaser, G. MazG — a regulator of programmed cell death in Escherichia coli. Mol Microbiol. 59, 590-601 (2006).
  5. Galperin, M. Y., Moroz, O. V., Wilson, K. S., Murzin, A. G. House cleaning, a part of good housekeeping. Mol Microbiol. 59, 5-19 (2006).
  6. Lee, S., et al. Crystal structure of Escherichia coli MazG, the regulator of nutritional stress response. J Biol Chem. 283, 15232-15240 (2008).
  7. Moroz, O. V., et al. Dimeric dUTPases, HisE, and MazG belong to a new superfamily of all-alpha NTP pyrophosphohydrolases with potential "house-cleaning" functions. J Mol Biol. 347, 243-255 (2005).
  8. Robinson, A., et al. A putative house-cleaning enzyme encoded within an integron array: 1.8 A crystal structure defines a new MazG subtype. Mol Microbiol. 66, 610-621 (2007).
  9. Moroz, O. V., et al. The crystal structure of a complex of Campylobacter jejuni dUTPase with substrate analogue sheds light on the mechanism and suggests the "basic module" for dimeric d(C/U)TPases. J Mol Biol. 342, 1583-1597 (2004).
  10. Green, M., Sambrook, J. . Molecular cloning: A laboratory Manual. 1, (2012).
  11. Brown, T. A. . Gene cloning an introduction. , (1986).
  12. Kim, M. I., Hong, M. Crystal structure of the Bacillus-conserved MazG protein, a nucleotide pyrophosphohydrolase. Biochem Biophys Res Commun. 472, 237-242 (2016).
  13. Sheehan, D. . Physical biochemistry: Principles and applications. , (2009).
  14. Lesley, S. A., Wilson, I. A. Protein production and crystallization at the joint center for structural genomics. J Struct Funct Genomics. 6, 71-79 (2005).
  15. Jeon, Y. J., et al. Structural and biochemical characterization of bacterial YpgQ protein reveals a metal-dependent nucleotide pyrophosphohydrolase. J Struct Biol. 195, 113-122 (2016).

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Citer Cet Article
Kim, M. I., Lee, C., Hong, M. Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG. J. Vis. Exp. (123), e55576, doi:10.3791/55576 (2017).

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