Summary

Стимуляция воспалительной реакции в первичной культурах гепатоцитов мышей

Published: March 10, 2017
doi:

Summary

Здесь мы покажем подход ферментативной для выделения первичных гепатоцитов от взрослых мышей, и мы опишем количественную оценку воспалительного ответа с использованием ELISA и ПЦР в реальном времени.

Abstract

Печень играет решающую роль в регуляции системного воспаления. При хроническом заболевании почек, в частности, печень реагирует в ответ на уремический среды, окислительный стресс, эндотоксемии и уменьшением клиренса циркулирующих провоспалительных цитокинов, производя большое количество острой фазы реагентов. Экспериментальные инструменты для изучения воспаления и основная роль гепатоциты имеют решающее значение для понимания регулирования и вклад печеночных цитокинов в системной ответной реакции острой фазы и пролонгированное провоспалительных сценарий, особенно в сложной обстановке, таких как хроническое заболевание почек. Поскольку исследования сложных механизмов воспаления в естественных условиях остается сложной, ресурсоемкой и обычно требует использования трансгенных животных, первичные изолированные гепатоциты обеспечивают надежный инструмент , чтобы получить механистические идеи в печеночную реакции острой фазы. Так как этот метод в пробирке особенности умеренные затраты, высокая повторнои общие продуктивность технических знаний, первичные изолированных гепатоцитах также могут быть легко использованы в качестве скринингового подхода. Здесь мы опишем метод ферментативного основе для выделения первичных гепатоцитов мышиными, и мы описываем оценку воспалительного ответа в этих клетках с помощью ELISA и количественный ПЦР в реальном времени.

Introduction

Хроническая болезнь почек (ХБП) может быть определена как состояние острого и хронического воспаления 1. У больных с ХПН, уровни сывороточной phosphaturic фактора роста фибробластов 23 гормона (FGF23) постепенно повышаться с целью поддержания гомеостаза сывороточного фосфата 2. Повышенные уровни сыворотки FGF23 независимо друг от друга связаны с сердечно – сосудистой заболеваемости и смертности среди пациентов , которые начинают лечение гемодиализом 3, 4. Кроме того, некоторые клинические исследования показали сильную корреляцию между повышенными уровнями FGF23 и сывороточные уровни С-реактивного белка (CRP), интерлейкин-6 (IL-6) и фактор некроза опухоли альфа (ФНО) 5, 6. Кроме того, в экспериментальном исследовании, недавно мы показали, что FGF23 может нацелены непосредственно на гепатоциты и вызывают воспалительную реакцию путем увеличения CRP и IL-6 рroduction в печени 7. Следовательно, FGF23 может выступать в качестве циркулирующего фактора, который вносит свой вклад в системное воспаление в CKD.

В начале 70 -х годов, первичные гепатоциты были выделены и изучены впервые 8. С тех пор первичные культивируемые клетки печени широко используются для изучения обмена веществ обработки, гормональной функции, метаболизм лекарств, токсичность, а также иммунитета и воспалительных реакций 9, 10. Предыдущие протоколы основном описывали ферментативную выделение первичных гепатоцитов из ткани печени человека 11, 12. В то время как отличной модели, это оставляет вне возможность изучить, как генетические манипуляции затрагивает сложные механизмы печеночная сигнализации, а также функциональные последствия при различных типах стимулов. Далее мы опишем выделение мышиных первичных гепатоцитов, Следует отметить, что эффект нескольких медиаторов печеночной реакции острой фазы, такие как липополисахарида (LPS), IL-6 и FGF23 могут быть проанализированы в легкой, быстрой и воспроизводимым способом 13.

В данном случае мы приводим протокол для ферментативной изоляции гепатоцитов от взрослых мышей, и показано, что установленные индукторов воспалений, такие как LPS и IL-6, а также к новым медиаторов воспаления, таких как FGF23, может непосредственно стимулировать экспрессию и секрецию воспалительные цитокины, такие как CRP и IL-6 в культуре гепатоцитов.

Protocol

Все протоколы животных и экспериментальные процедуры были одобрены Animal Care и использование комитета Institutional (IACUC) из Университета Майами Миллер Школа медицины мимо. 1. Подготовка Подогрейте перфузии печени человека средств массовой информации и переваривания пече?…

Representative Results

гистология Представительные световой микроскопии образы первичных выделенных и культивируемых клеток изображены на рисунке 1А. Иммуноцитохимическая анализ показывает, что изолированные гепатоциты высоко выражают альбумин …

Discussion

Разделительный первичных гепатоцитов у мышей является быстрым, недорогим и надежным инструментом для изучения воспалительных реакций бывших естественных условиях. Если выполнены правильно, результаты могут быть легко сгенерирована и воспроизведена в своевременной и экономиче…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана NIH (R01HL128714 к CF) и (F31DK10236101 к КС) и Американской ассоциации сердца (CF и AG).

Materials

Consumables
Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer Falcon 352350
BD Insyte Autoguard BD 381412
50 mL Polypropylene Conical Tube Falcon 352098
100 6-inch Cotton Tipped Applicators  Puritan 806-WC
1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 Becton Dickinson 329420
Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style Corning 353003
6 well Cell Culture Cluster Costar 3516
5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) LOOK SP115
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Minipuls 3 Perfusion Pump Gilson F155007
Hemacytometer Kits, Propper VWR 48300-474
Hemacytometer Cover Glasses, Propper VWR 48300-470
Surgical Scissers – Sharp/Blunt F.S.T. 14001-12
Iris Scissors-ToughCut Straight F.S.T. 14058-11
Dumont SS-45 Forceps F.S.T. 11203-25
Student Tissue Forceps F.S.T. 991121-12
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acetic acid solution, 2.0 N Sigma     A8976-100ML
Isoflurane, USP 250 mL Piramal Healthcare    66794-013-25
KetaVed 1000mg/10mL (100mg/mL) VEDCO     50989-161-06
Xylazine 100 mg/mL AnaSed Injection 139-236
Willams' Medium E (1x) gibco 12551-032
Liver Perfusion Medium (1x) gibco 17701-038
Liver Digest Medium (1x) Life Technologies 17703034
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements Life Technologies CM3000
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements Life Technologies CM4000
Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 ThermoFisher scientific 10010031
Collagen Type 1 Corning 354236
Trypan Blue Solution VWR 45000-717

References

  1. Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
  2. Isakova, T., et al. Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease. Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).
  3. Faul, C., et al. FGF23 induces left ventricular hypertrophy. J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).
  4. Gutiérrez, O. M., et al. Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis. N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).
  5. Munoz Mendoza, J., et al. Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).
  6. Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults. PLoS ONE. 10 (3), e0122885 (2015).
  7. Singh, S., et al. Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease. Kidney Int. , 1-12 (2016).
  8. Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
  9. Moshage, H. J., et al. The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes. Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).
  10. Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).
  11. Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
  12. Kegel, V., et al. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J Vis Exp. (109), (2016).
  13. Moshage, H., et al. Cytokines and the hepatic acute phase response. J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).
  14. Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
  15. Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
  16. Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).
  17. Grabner, A., et al. Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy. Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).
  18. Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).

Play Video

Citer Cet Article
Czaya, B., Singh, S., Yanucil, C., Schramm, K., Faul, C., Grabner, A. Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice. J. Vis. Exp. (121), e55319, doi:10.3791/55319 (2017).

View Video