Summary

L'induction d'une réponse inflammatoire dans les cultures hépatocytes primaires de souris

Published: March 10, 2017
doi:

Summary

Ici, nous montrons une approche enzymatique pour isoler des hépatocytes primaires de souris adultes, et nous décrivons la quantification d'une réponse inflammatoire par ELISA et la PCR en temps réel.

Abstract

Le foie joue un rôle décisif dans la régulation de l'inflammation systémique. Dans la maladie rénale chronique, en particulier, le foie réagit en réponse au milieu urémique, le stress oxydatif, l'endotoxémie et la diminution de la clairance de la circulation cytokines pro-inflammatoires par la production d'un grand nombre de réactifs de phase aiguë. inflammation des outils expérimentaux pour étudier et le rôle sous-jacent des hépatocytes sont cruciales pour comprendre la régulation et la contribution des cytokines hépatiques à une réponse en phase aiguë systémique et un scénario pro-inflammatoire prolongée, en particulier dans un cadre complexe comme la maladie rénale chronique. Depuis l' étude des mécanismes complexes de l' inflammation in vivo reste difficile, de ressources et nécessite généralement l'utilisation d'animaux transgéniques, les hépatocytes isolés primaires constituent un outil robuste pour acquérir des connaissances mécanistes dans la réponse de phase aiguë hépatique. Cette technique in vitro comporte des coûts modérés, élevés reproductibilité et de la connaissance technique commune, hépatocytes isolés primaires peuvent également être facilement utilisé comme une approche de dépistage. Ici, nous décrivons une méthode enzymatique basée à isoler les hépatocytes primaires de souris, et on décrit l'évaluation d'une réponse inflammatoire dans ces cellules en utilisant la méthode ELISA et la PCR quantitative en temps réel.

Introduction

L' insuffisance rénale chronique (CKD) peut être définie comme un état d'inflammation aiguë et chronique 1. Chez les patients atteints de néphropathie chronique, les niveaux de l'hormone de croissance des fibroblastes facteur phosphaturique 23 (FGF23) sériques augmentent progressivement afin de maintenir l' homéostasie du phosphate sérique 2. Niveaux de FGF23 sérique accrus sont indépendamment associés à la morbidité et la mortalité cardiovasculaire chez les patients qui commencent un traitement d'hémodialyse 3, 4. En outre, plusieurs études cliniques ont montré une forte corrélation entre les niveaux de FGF23 élevés et des niveaux de protéine C-réactive (CRP), l' interleukine-6 (IL-6) et facteur de nécrose tumorale α (TNF) 5, 6 sérum. En outre, dans une étude expérimentale, nous avons récemment démontré que FGF23 peut cibler directement les hépatocytes et provoquer une réponse inflammatoire en augmentant la CRP et l'IL-6 production dans le foie 7. Par conséquent, le FGF23 pourrait agir comme un facteur de circulation qui contribue à l'inflammation systémique CKD.

Dans les années 70, les hépatocytes primaires ont été isolées et étudiées pour la première fois 8. Depuis lors , les cellules hépatiques en culture primaire ont été largement utilisées pour étudier la transformation métabolique, de la fonction hormonale, le métabolisme des médicaments et de la toxicité, ainsi que l' immunité et les réponses inflammatoires 9, 10. Protocoles précédents ont principalement décrit l'isolement enzymatique des hépatocytes primaires à partir de tissus de foie humain 11, 12. Alors un excellent modèle, ce qui laisse la possibilité d'étudier la façon dont la manipulation génétique affecte les mécanismes de signalisation hépatique complexes ainsi que des conséquences fonctionnelles sur différents types de stimuli. Dans ce qui suit, nous décrivons l'isolement des hépatocytes primaires murins. Notamment, l'effet de plusieurs médiateurs de la réponse de phase aiguë hépatique, comme le lipopolysaccharide (LPS), IL-6 et FGF23 peut être analysé d'une manière facile, rapide et reproductible 13.

Ici, nous présentons un protocole pour l'isolement enzymatique des hépatocytes de souris adultes et nous démontrons que les inducteurs établies de l'inflammation, tels que le LPS et l'IL-6, ainsi que des médiateurs inflammatoires nouveaux tels que le FGF23, peuvent stimuler directement l'expression et la sécrétion de les cytokines inflammatoires, telles que la CRP et IL-6 dans des hépatocytes cultivés.

Protocol

Tous les protocoles des animaux et des procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Université de Miami Miller School of Medicine. 1. Préparation les médias et le foie de perfusion du foie Préchauffer digérer les médias dans un bain d'eau à 37 ° C. Mettre en place une pompe à perfusion (30 mL / min). pré-remplir soigneusement le système de tuyauterie de la pompe avec …

Representative Results

Histologie Représentatifs des images de microscopie de lumière de cellules isolées et cultivées primaires sont représentées sur la figure 1A. Analyse immunocytochimique démontre que des hépatocytes isolés expriment fortement l'albumine (rouge) ainsi que des récepteurs de croissance des fibroblastes facteur 4 (FGFR4) (vert). Les noyaux sont colorés avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (b…

Discussion

Isoler hépatocytes primaires de souris est un outil rapide, peu coûteux et fiable pour étudier les réponses inflammatoires ex vivo. Si effectué correctement, les résultats peuvent être facilement générés et reproduits en temps opportun et rentable. Les points suivants doivent être évalués avec soin afin d'assurer une isolation efficace.

L'incision chirurgicale et de la canulation de la VCI doivent être effectuées sous anesthésie générale et non pas après l…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le NIH (R01HL128714 à CF) et (F31DK10236101 à KS) et l'American Heart Association (CF et AG).

Materials

Consumables
Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer Falcon 352350
BD Insyte Autoguard BD 381412
50 mL Polypropylene Conical Tube Falcon 352098
100 6-inch Cotton Tipped Applicators  Puritan 806-WC
1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 Becton Dickinson 329420
Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style Corning 353003
6 well Cell Culture Cluster Costar 3516
5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) LOOK SP115
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Minipuls 3 Perfusion Pump Gilson F155007
Hemacytometer Kits, Propper VWR 48300-474
Hemacytometer Cover Glasses, Propper VWR 48300-470
Surgical Scissers – Sharp/Blunt F.S.T. 14001-12
Iris Scissors-ToughCut Straight F.S.T. 14058-11
Dumont SS-45 Forceps F.S.T. 11203-25
Student Tissue Forceps F.S.T. 991121-12
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acetic acid solution, 2.0 N Sigma     A8976-100ML
Isoflurane, USP 250 mL Piramal Healthcare    66794-013-25
KetaVed 1000mg/10mL (100mg/mL) VEDCO     50989-161-06
Xylazine 100 mg/mL AnaSed Injection 139-236
Willams' Medium E (1x) gibco 12551-032
Liver Perfusion Medium (1x) gibco 17701-038
Liver Digest Medium (1x) Life Technologies 17703034
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements Life Technologies CM3000
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements Life Technologies CM4000
Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 ThermoFisher scientific 10010031
Collagen Type 1 Corning 354236
Trypan Blue Solution VWR 45000-717

References

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Citer Cet Article
Czaya, B., Singh, S., Yanucil, C., Schramm, K., Faul, C., Grabner, A. Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice. J. Vis. Exp. (121), e55319, doi:10.3791/55319 (2017).

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