Summary

In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen

Published: March 16, 2017
doi:

Summary

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Abstract

De placenta is het eerste orgaan optreden tijdens embryogenese en is nodig voor de overleving van het ontwikkelende embryo. De placenta bestaat uit verschillende trofoblastcellen dat onderscheiden van de extra-embryonale trophectoderm cellen van de inplanting blastocyst. Als zodanig is ons begrip van de vroege differentiatie gebeurtenissen van de menselijke placenta beperkt omwille van ethische en juridische beperkingen op de isolatie en manipulatie van de menselijke embryogenese. Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) is een robuust modelsysteem voor het onderzoeken van menselijke ontwikkeling en kan ook in vitro worden gedifferentieerd tot cellen die markers trofoblastische van de trofoblast verschillende celtypen tot expressie. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor differentiatie hPSCs in trofoblastcellen behulp botmorfogeen eiwit 4 en remmers van de activine / Nodal signaalroutes. Dit protocol genereert verschillende trofoblast celtypes die kunnen worden getransfecteerd met siRNAvoor het onderzoeken van het verlies-van-functie fenotypes of kunnen worden besmet met ziektekiemen. Bovendien kan hPSCs genetisch worden gemodificeerd en vervolgens onderverdeeld in trofoblast progenitors voor gain-of-function analyses. Deze in vitro differentiatie werkwijze voor het genereren van menselijke trophoblasts vanaf hPSCs overwint de ethische en wettelijke beperkingen van het werken met vroege menselijke embryo's, en het systeem kan worden gebruikt voor diverse toepassingen, zoals geneesmiddelen en stamcelonderzoek.

Introduction

De placenta is nodig voor de groei en overleving van de foetus tijdens de zwangerschap en vergemakkelijkt de uitwisseling van gassen, voedingsstoffen, afvalstoffen, hormonen en tussen maternale en foetale bloedsomloop. Het eerste orgaan gevormd tijdens embryogenese zoogdieren is de placenta, die begint ontwikkelen 6-7 dagen na de bevruchting bij de mens en bij muizen 3,5-4,5 dagen 1, 2, 3, 4. Trofoblastcellen zijn de belangrijkste cellen van de placenta, en deze cellen vertegenwoordigen één van de eerste lijn differentiatie gebeurtenissen bij zoogdieren embryo. Ze ontstaan ​​uit de buitenste extra-embryonale trophectoderm cellen van de pre-implantatie blastocyst. Onze kennis van de vroege stadia van ontwikkeling van de placenta wordt beperkt door ethische en logistieke beperkingen modelleren vroege menselijke ontwikkeling.

Tijdens de embryonale implantatie, trofoblastenbinnenvallen de moederlijke epitheel en differentiëren in gespecialiseerde stamcellen 5. Cytotrofoblasten (CTBS) worden mononucleaire, ongedifferentieerde voorlopers die fuseren en differentiëren in syncytiotrofoblasten (SYN) en extravilleuze invasieve trofoblasten (EVTS), dat anker de placenta naar de baarmoeder. SYN zijn meerkernige, terminaal gedifferentieerde cellen die hormonen noodzakelijk voor het behoud van de zwangerschap synthetiseren. De vroege differentiatie gebeurtenissen die EVTS en SYN genereren zijn essentieel voor de vorming van de placenta, zoals stoornissen in trophoblastic cellen resulteren in een miskraam, pre-eclampsie, en Dysmaturiteit 1. De typen humane trofoblast cellijnen die zijn ontwikkeld onder onsterfelijk CTBS en choriocarcinomas, die placenta hormonen en weergave invasieve eigenschappen 6 produceren. Primaire trophoblastic cellen van het eerste trimester placenta mens kan worden geïsoleerd, maar de cellen snel differentiate en stoppen prolifererende in vitro. Belangrijk is getransformeerd en primaire cellijnen hebben verschillende genexpressie profielen, wat aangeeft dat tumorigene en onsterfelijk trofoblast cellijnen primaire trophoblasts 7 niet nauwkeurig kan vertegenwoordigen. Bovendien, deze lijnen is het onwaarschijnlijk dat de placenta trofoblast stamcellen voorlopers lijken, omdat ze voor het eerst zijn afgeleid van later stadium via derde trimester.

Er is behoefte aan een krachtige in vitro kweeksysteem van beginnende menselijke trophoblasts om de vroege gebeurtenissen van placenta vorming en functie te bestuderen. Humane embryonale stamcellen (hESCs), welke eigenschappen de binnenste celmassa van pre-implantatie embryo delen worden vaak gebruikt om vroege menselijke Ontwikkelmodel, waaronder de vorming van de vroege placenta. Zowel menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) en hESCs kunnen worden onderscheiden in trophoblasts in vitro met behulp van Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Deze omzetting van pluripotente cellen trofoblastcellen behulp BMP4 specifiek is voor humane cellen en wordt veel gebruikt om de ontwikkeling van de vroege menselijke placenta te bestuderen omdat het geen toegang heeft tot vroege menselijke embryo 9, 16 noodzakelijk. Recent werd ontdekt dat het toevoegen van de remmers A83-01 (A) en PD173074 (P), die de SMAD2 / 3 en MEK1 / 2 signaleringsroutes te blokkeren, verhoogt de efficiëntie van differentiatie in HPSC trophectoderm-achtige stamcellen voornamelijk SYN en EVTS zonder uitgebreide vorming van mesoderm, endoderm of ectoderm cellen 9, 17 </sup>. Met deze mediumomstandigheden, hESCs gedifferentieerd gedurende 12 dagen vergelijkbare genexpressie profielen trophectoderm cellen geïsoleerd uit menselijke blastocyst-stadium embryo en scheiden verschillende placenta-specifieke groeihormonen, ondersteunt de validiteit van deze in vitro modelsysteem 9, 11. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de in vitro differentiatie van hPSCs in humane trofoblast voorlopers gebruikt BMP4 / A / P cultuurmedium. Deze omstandigheden produceren overvloedige aantallen cellen voor een groot aantal toepassingen, waaronder RNA sequentie, gendisruptie behulp siRNA, pathogeen infecties en genetische modificatie onder toepassing van lipofectie-gemedieerde transfectie.

Protocol

LET OP: Voor de differentiatie van beide hESCs of hiPSCs in trofoblast voorlopers, hPSCs geteeld op muis embryonale fibroblasten (MEF) worden overgebracht naar feeder-vrije omstandigheden gedurende twee passages voor het begin van differentiatie met BMP4 / A / P. Dit proces elimineert de MEF besmetting van gedifferentieerde cellen. Hier presenteren we een protocol voor differentiatie hESC en hetzelfde protocol kan worden toegepast hiPSCs. 1. Cultuur en herstel van hESCs op bestraalde muis embryonale fibroblasten (…

Representative Results

Overzicht van In Vitro Differentiatie van hPSCs Dit in vitro differentiatie protocol begint met ongedifferentieerde hESC 's geteeld op MEF die worden overgebracht naar feeder-vrije omstandigheden gedurende één doorgang (Figuur 1A). Terwijl we de differentiatie van hESC 's beschreven in dit protocol, gebruikten we dit protocol om hiPSCs succesvol differentiëren in trofoblastische celle…

Discussion

We presenteerden de basisstappen voor de differentiatie hESCs in trophoblast voorlopers. Dit protocol is onlangs geoptimaliseerd om hESCs snel onderscheid met de toevoeging van activine / Nodal signalering remmers, waardoor de differentiatie trofoblastcellen en het vermijden van de vorming van mesoderm voorlopers, die typisch waargenomen BMP4 behandeling alleen. Het BMP4 model systeem maakt het mogelijk voor het onderzoek van de vroegste stadia van de menselijke afstamming trophoblast specificatie en expansie. Daarnaast…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.

Materials

DMEM/F12 Invitrogen 11330-057
Knock Out Serum Replacement Invitrogen 10828-028 This is referred to as "serum replacement" in this protocol.
NEAA Invitrogen 11140-050
FBS Invitrogen 16000-044
L-Glutamine Invitrogen 10828-028
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-155
2-Mercaptoethanol Sigma M-7522
B-FGF Millipore GF-003
DMEM Invitrogen 11965-118
Dispase Invitrogen 17105-041
Collagenase Type IV Invitrogen 17104-019
Rock inhibitor Y27632 Calbiochem 688000
Irradiated CF1 MEFs GlobalStem 6001G MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.
0.22 um syringe filter Millipore SLGS033SS
Heracell 150i low oxygen incubator Heracell/VWR 89187-192 Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.
BMP4 R&D Systems 314-BP-01M
A 83-01 R&D Systems 2939/10
PD173074 R&D Systems 3044/10
RNAiMax Invitrogen 13778150
Trizol ThermoFisher 15596026 Trizol is used to isolate total RNA.
X-tremeGENE 9 Roche 6365779001
Matrigel Corning 356231 This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol.

References

  1. Rugg-Gunn, P. J. Epigenetic features of the mouse trophoblast. Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).
  2. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  3. Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
  4. Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
  5. Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
  6. Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
  7. Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
  8. Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
  9. Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
  10. Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
  11. Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
  12. Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
  13. Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
  14. Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
  15. Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
  16. Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?. Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
  17. Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
  18. Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
  19. Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
  20. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
  21. Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
  22. Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
  23. Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082 (2009).
  24. Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
  25. Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
  26. Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
  27. Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
  28. Cole, L. A. Hyperglycosylated hCG, a review. Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).
  29. Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).

Play Video

Citer Cet Article
Wang, J., Anguera, M. C. In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells. J. Vis. Exp. (121), e55268, doi:10.3791/55268 (2017).

View Video