אפיון proteomic SILAC מבוסס של Exosomes מ- HIV-1 תאים נגועים
Summary
כאן, אנו מתארים שיטה פרוטאומיקה כמותית באמצעות טכניקה של תיוג איזוטופ יציב על ידי חומצות אמינו תרבית תאים (SILAC) כדי לנתח את ההשפעות של זיהום HIV-1 על proteomes מארח exosomal. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאם תאים בתנאי קיצון או זיהום שונים.
Abstract
Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.
Introduction
מחל אנושיות רבות, כוללים זיהומים נגיפיים, הקשורים לעתים קרובות עם תהליכים תאיים ייחודיים המתרחשים בתוך ומסביב התאים הנגועים. חלבונים, לעיתים קרובות מתנהג כמו effectors הסלולר האולטימטיבי, לתווך תהליכים אלה. ניתוח של חלבונים יכול לעיתים קרובות לספק מידע רב ערך לגבי הסביבה המקומית של התאים הנגועים ולעזור לנו להבין את המנגנון הבסיסי של בהיווצרות המחלה. בין טכניקות ניתוח חלבון שונות, פרוטאומיקה מחזיקה במיוחד הבטחה גדולה. ככלי רב עוצמה, בקנה מידה גדול, פרוטאומיקה יכול לספק הבנה מערכתית של תהליכים תאיים, במיוחד בתחום של הפונקציה ואת האינטראקציה של חלבונים. ניתוח חלבונים ספציפיים נעשה פשוט יותר באמצעות הפיתוח של טכניקות תיוג, המאפשרות לחוקרים לעקוב אחר הביטוי של מרכיבים תאיים, במיוחד חלבונים, באתר של חקירה. למרות ניתוחים proteomic רבים בוצעו על הסלולרסולם proteome, אפיוני proteomic על תאי subcellular הוכיח להיות במיוחד אינפורמטיבי 1. זה בא לידי ביטוי גם במחקרים של הידבקות ב- HIV-1.
Exosomes, 30-100 שלפוחית קרום ננומטר המופרש על ידי מגוון רחב של סוגי תאים 2, 3, הם מרכיבים קריטיים של תקשורת בין תאית ותחבורה מולקולרית. הם התגלו בעבר למלא תפקידים חשובים בתהליך 4 ניצני HIV-1, 5. על ידי שילוב של ניתוח proteomic עם לנתיחה פונקציונלית, מצאנו כי exosomes שוחרר מבית HIV-1 תאים נגועים מורכב מולקולות רגולטוריות חתימה ונמל חלבון ייחודיות כמותית שונים המשפיעות תכונות הסלולר על תאי שכנים פתוחים, כוללים אפופטוזיס הסלולר ושגשוגם 6. השיטות מתוארות פרוטוקול זה,כלומר SILAC (תיוג איזוטופ יציב על ידי חומצות אמינו תרבית תאים) 7 אפיון proteomic מבוסס של exosomes מתאי נגועים ב- HIV-1. ניתן ליישם גישות דומות כדי להבין טוב יותר תאים subcellular אחרים בזמן בפתוגנזה ידי התאמת הלחץ ניסיוני לתא או חלק מסוים של עניין ולהפוך את השינויים הדרושים כדי ההליכים המתוארים.
בהינתן ההתפתחות האחרונה של שיטות proteomic כמוני, יש הרבה לבחירה בעת בחירת השיטה היעילה ביותר עבור ניסוי מסוים. ביניהם ניתן למנות את iTRAQ מבוסס הכימי (תגי isobaric כימות יחסית ומוחלטת) 8 ואת ללא התווית MRM (ניטור תגובה מרובה) 9 טכניקות. שתי השיטות הם כלים רבי עוצמה הם בחירה טובה עבור הגדרות ספציפיות. עבור מעבדה אופיינית בעיקר בעבודה עם שורות תאים, עם זאת, יש שתי שיטות אלה relatively עלויות גבוהות יותר והם יותר זמן רב בהשוואה לשיטה המבוססת SILAC. SILAC היא טכניקה תיוג מבוסס מטבולית המשלבת צורות איזוטופי nonradioactive של חומצות אמינו מן התקשורת והתרבות לתוך חלבונים תאיים. בדרך כלל, ניסויי SILAC להתחיל עם שתי אוכלוסיות תאים, למשל, נגוע נגוע. כל שכותרתו דיפרנציאלי בסביבת איזוטופים הספציפית שלה עד תיוג מלא מושגת. Exosomes שכותרתו של תאים אלה חשופים אז כדי מיצוי חלבון. לאחר שחולץ, חלבוני exosomal שכותרתו מנותחים באמצעות ספקטרוסקופיית מסות טנדם כרומטוגרפיה הנוזלית 10. לבסוף, את התוצאות ספקטרומטריית מסה וחלבונים שכותרתו משמעותית חשופים סטטיסטי וביואינפורמטיקה מנתח וכן אימות ביוכימיים קפדנית. התחקירים הקודמים שלנו מראים כי נהלי SILAC / exosome מתאימים יותר עבור שורות תאים מאשר תאים ראשוניים, כמו שורות תאים בדרך כלל נמצאותמדינה מתרבה פעילה עבור תיוג איזוטופי יעיל,
Protocol
Representative Results
Discussion
בשנת ההליכים המתוארים במאמר זה, אנו הוכחנו את היישום של טכניקת SILAC כדי לחקור את ההשפעה של זיהום HIV-1 על proteome המארח exosomal. בתחילה, נגוע ו- HIV-1 תאים נגועים הם איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. Exosomes שכותרתו דיפרנציאלי אז הם מטוהרים לפני ביצוע מיצוי חלבון. לאחר מכן, ספקטרומטריית מס?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תוספת ערה לאורך החיים / טאפטס / בראון וכפר, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693, ו K24HD080539 כדי BR. עבודה זו נתמכה גם על ידי קרן המחקר פיילוט תוחלת חיים (# 701- 5857), רוד איילנד קרן למחקר רפואי גרנט (# 20,133,969), ו- NIH COBRE URI / קריווי פיילוט מענק מחקר (P20GM104317) כדי ML. אנו מודים ג'יימס Myall ו Vy דאנג לעזרה בהכנת כתב היד דמות.
Materials
| H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
| Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
| Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000g |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
| Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
| Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
| Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |
References
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
- Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
- Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
- Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
- Strober, W. . Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
- Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).
- Olson, B. J. S. C., Markwell, J. . Current Protocols in Protein Science. , (2001).
- Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
- Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
- Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
- Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, 417-422 (2009).
- Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, 561-568 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
- Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
- Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).
