Summary

Transplantes competitivos para avaliar hematopoéticas aptidão Stem Cell

Published: August 31, 2016
doi:

Summary

This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.

Abstract

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.

Introduction

A hematopoiese é um processo regenerativo que garante o reabastecimento das células do sangue que foram perdidos devido a uma lesão, a radiação e a morte celular. Este processo é assegurada por células estaminais hematopoiéticas (HSC), que em grande parte residem na medula óssea de adultos. Além disso, as células estaminais hematopoiéticas podem ser utilizados para fins terapêuticos em doenças auto-imunes, doenças malignas hematológicas e imunodeficiências 1. Assim, há uma necessidade de compreender melhor os mecanismos que regulam a função HSC, incluindo sua expansão proliferativa e sua capacidade de alcançar e enxertar a medula óssea receptor após o transplante. Embora estudos recentes tenham relatado vários marcadores de superfície celular, incluindo os membros da família SLAM CD150 e CD48, para enriquecer prospectivamente HSCs adultos e fetais HSCs para aproximadamente 50% de pureza 2-4, a medida padrão de ouro para hsc funcional permanece um ensaio in vivo para repovoar determinar a sua capacidade de restabelecer sangue cprodução ell em um host irradiado 5.

O ensaio de repovoamento clonal in vivo foi inicialmente desenvolvido por Till e McCulloch 6 e desde então tem sido aperfeiçoado e expandido. Tal como inicialmente definido, HSCs garantir a produção de glóbulos ao longo da vida através da auto-renovação e diferenciação. A transferência de HSCs para um destinatário irradiado permite-nos assim a avaliar: a sua capacidade de se diferenciar por meio da análise das diferentes linhagens de células sanguíneas (linfócitos T, linfócitos B, granulócitos, monócitos) e a sua capacidade de auto-renovação por transplante em série. O ensaio que geralmente envolvem a comparação da funcionalidade e / ou a quantidade de duas populações de HSCs, por exemplo, células provenientes de dois ratinhos de diferentes genótipos ou células que foram tratadas ou não tratadas com diferentes factores que podem influenciar a manutenção ou expansão de HSCs em cultura. quimerismo doador, ou a contribuição de doadores transferidos HSCs tO produção de células sanguíneas pode ser então determinada por análise de citometria de fluxo no sangue periférico e de medula óssea por meio de marcadores de superfície celular ou outros métodos que irão distinguir células dadoras do recipiente, ou hospedeiro. Os marcadores mais utilizados são certamente os dois alelos para o gene Ptprc ou antígeno CD45 leucócitos 7 que temos escolhido para os exemplos fornecidos abaixo.

O ensaio de repovoamento clonal pode ser competitiva ou não competitiva. Em uma configuração não-competitivo, de controlo e de teste HSCs são transferidos para ratinhos receptores separados e os resultados para cada tipo de célula será independente da outra. Num ambiente competitivo, a função tanto de teste e de controlo HSCs é medido contra uma população de HSCs concorrente. O protocolo descrito aqui usa a configuração competitiva, mas também pode ser adaptado para situações não-competitivas. Ambas as abordagens têm suas vantagens e limitações, e vamos compará-las em detalhe nodiscussão. Nós também descrevem abordagens diferentes para garantir a equidade no número de HSCs transplantadas, explicam como adaptar o ensaio para a quantificação de HSCs, limitando ensaio de diluição (LDA), e fornecer exemplos de ambos os transplantes de bem e mal sucedidas para a interpretação dos resultados.

Protocol

Todos os procedimentos descritos neste protocolo ter sido aprovado pelo comitê de ética animal institucional e seguir o Canadian Council on Animal Care orientações. Nota: Para manter condições estéreis / ou específicas isentos de agentes patogénicos de habitação, realizar todos os procedimentos que envolvem a manipulação direta de ratos vivos dentro de uma cabine de segurança biológica ou uma capela de fluxo laminar. Limpe ou esterilizar gaiolas, dispositivos de retenção, ma…

Representative Results

Uma descrição geral da definição de transplante competitivo, incluindo transplantes secundárias (discutido mais adiante) pode ser encontrada na Figura 1. A análise representativa de medula pré-transplante ósseo HSCs pode ser encontrada na Figura 2. Informações mais detalhadas sobre a exclusão de dobletes e células mortas pode ser encontrada em outros lugares 9. A…

Discussion

O protocolo aqui descrito destina-se a avaliar a aptidão relativa de dadores (teste) HSCs contra competidor conhecido HSCs. A situação de concorrência aumenta a sensibilidade relativa do ensaio (maior probabilidade de detectar reduções moderadas na aptidão de células-tronco) e fornece um controle técnico interno para a eficácia da irradiação e injeção. No entanto, ele não deve ser utilizado como uma medida absoluta de HSC aptidão; uma diminuição na reconstituição competitivo não significa automatica…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Somos gratos a Roxann Hétu-Arbour para a assistência com o design figura e demonstração dos procedimentos. Pesquisa no laboratório foi apoiado por uma concessão de Transição da Fundação Cole, Descoberta conceder nenhuma. 419226-2012 das Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Investigação do Canadá (NSERC) e da Fundação Canadense para a Inovação (CFI Líderes Fundo conceder no. 31377). KMH é um Chercheur-Boursier Júnior para o Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS).

Materials

Microtainer tubes with K2EDTA BD Biosciences 365974
20G needle BD Syringe For blood sampling from the mandibular vein
LabQuake Shaker rotisserie Thermo  Scientific C415110 Any other rotating mixer will work as well to prevent coagulation of blood samples
Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) BD Biosciences 2.50 553142 Alternatively use clone 93 from eBioscience (cat # 14-0161) or Biolegend (cat# 101310) 
Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) eBioscience 0.25 25-0031 For most flow cytometry antibodies, the clone is important but the colours and companies can vary depending on the available equipment
PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) eBioscience 0.25 12-0193
APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) eBioscience 0.25 47-5931
FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) eBioscience 2.50 11-0453
eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) eBioscience 1.00 48-0454
Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) eBioscience 1.25 13-0452
Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) eBioscience 1.25 13-0031
Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) eBioscience 1.25 13-0112
Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) eBioscience 1.25 13-5931
Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) eBioscience 0.63 13-5921
V500 streptavidin BD Biosciences 0.50 561419
PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) BD Biosciences 0.25 553355
PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) BD Biosciences 0.25 558162
PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) eBioscience 0.50 46-1351
Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) Biolegend 0.63 115918 BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone
1ml tuberculin syringe with 27G needle BD Syringe 309623
1ml tuberculin syringe with 25G needle BD Syringe 309626
70 um cell strainer BD Falcon 352350

References

  1. Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
  2. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  3. Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
  4. Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
  5. Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
  6. Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
  7. Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
  8. . Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
  9. Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
  10. Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
  11. Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).
  12. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  13. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
  14. Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
  15. Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
  16. Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
  17. Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
  18. Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
  19. Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
  20. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
  21. Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
  22. Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
  23. McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).

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Citer Cet Article
Kwarteng, E. O., Heinonen, K. M. Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness. J. Vis. Exp. (114), e54345, doi:10.3791/54345 (2016).

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