This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.
The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.
조혈 부상 방사선 및 세포 사멸을 통해 손실 된 혈액 세포의 보충을 보장하는 재생 방법이다. 이 과정은 주로 성인 골수에있는 조혈 줄기 세포 (HSC)에 의해 보장된다. 또한, 조혈 줄기 세포는자가 면역 질환, 혈액 학적 악성 종양과 immunodeficiencies 1 치료 목적을 위해 사용될 수있다. 더 잘 증식 팽창 도달 이식 후 수신자 골수 생착 할 수있는 능력을 포함하여, HSC 기능을 조절하는 메카니즘을 이해하기위한 요구가있다. 최근의 연구는 전향 적으로 약 50 % 순도 2-4로 성인 조혈 모세포와 태아의 조혈 모세포를 풍부하게 할 수있는 SLAM의 가족 CD150과 CD48 등 여러 가지 세포 표면 마커를보고 있지만, 기능 조혈 모세포의 황금 표준 측정에 대한 생체 다시 채우기 분석 유지 혈액 C를 재 구축하는 능력을 결정조사 된 호스트 (5)의 엘 생산.
생체 내 클론을 다시 채우는 분석은 처음 틸과 맥 컬록 (6)에 의해 개발 된 이후 세련되고 확장되었습니다. 원래 정의 된 조혈 모세포는자가 재생과 분화를 통해 평생 혈액 세포의 생산을 보장합니다. 조사 된받는 사람에 조혈 모세포의 전송 따라서 우리가 평가할 수 있습니다 : 다른 혈액 세포 계통의 분석을 통해 (T 림프구, B 림프구, 과립구, 단구) 및 직렬 이식을 통해 자기 갱신 능력을 차별화 할 수있는 능력. 상기 분석은 일반적으로 조혈 두 집단의 기능 및 / 또는 양의 비교를 포함하는 것, 예를 들어, 치료 또는 조혈 모세포의 유지 또는 확장에 영향을 줄 수있는 다른 요인들과 미처리 된 다른 유전자형 또는 셀 개의 마우스로부터 오는 세포 문화입니다. 기증자 키메라, 또는 전송 기증자의 조혈 모세포의 t의 기여O 혈액 세포 생산 후 세포 표면 마커 또는 수신자 또는 호스트에서 공여 세포를 구별 할 다른 방법을 이용하여 말초 혈액의 유동 세포 계측법 분석 골수에 의해 결정될 수있다. 가장 널리 사용되는 마커는 확실히 우리가 아래의 예에 대해 선택한 유전자 Ptprc 또는 CD45 백혈구 항원 (7)의 두 대립 유전자이다.
클론 다시 채우기 분석은 경쟁 또는 비 경쟁이 될 수 있습니다. 비경쟁 설정에서, 제어 및 테스트 조혈 별도받는 마우스에 전달되고, 각각의 셀 유형의 결과는 서로 독립적 일 것이다. 경쟁 설정에서 테스트 및 제어 모두 조혈 모세포의 기능은 경쟁 조혈 모세포의 인구에 대해 측정된다. 여기에 설명 된 프로토콜 경쟁 설정을 사용뿐만 아니라 비경쟁 상황에 적응 될 수있다. 두 방법은 자신의 장점과 한계를 가지고, 우리는에서 자세히를 비교합니다토론. 우리는 또한 이식 된 조혈 모세포의 수의 주식을 보장하기 위해 다른 방법을 설명, 희석 분석 (LDA)을 제한함으로써 조혈 모세포의 정량 분석을 적용, 결과의 해석에 대한 성공 및 실패 이식 모두의 예제를 제공하는 방법에 대해 설명합니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 알려진 경쟁 조혈 모세포에 대한 기증자 (테스트) 조혈 모세포의 상대적 적합성을 평가하기 위해 설계되었습니다. 경쟁 상황 (줄기 세포 니스 완만 저하를 검출 할 가능성) 분석의 상대 감도를 높이고 조사 주입의 효능에 대한 내부 기술적 인 제어를 제공한다. 그러나, HSC 적당의 절대 측정으로서 사용되어서는 안된다; 경쟁 재구성 감소 자동 조혈 경쟁의 부재 하에서도…
The authors have nothing to disclose.
우리는 절차의 그림 디자인 및 데모와 지원을 Roxann Hétu – 아버에 감사하고 있습니다. 실험실에서 연구가 콜 재단에서 전환 수상에 의해 지원되었다, 검색없이 부여합니다. 자연 과학 및 캐나다 (NSERC)의 공학 연구 협의회 및 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI 지도자 기금 없음. 31377 부여) 419226-2012. 상테 (FRQS) – KMH는 퐁 드 공들인 뒤 퀘벡에 대한 Chercheur – Boursier 주니어입니다.
Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | ||
20G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | ||
LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | Any other rotating mixer will work as well to prevent coagulation of blood samples | |
Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 2.50 | 553142 | Alternatively use clone 93 from eBioscience (cat # 14-0161) or Biolegend (cat# 101310) |
Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 0.25 | 25-0031 | For most flow cytometry antibodies, the clone is important but the colours and companies can vary depending on the available equipment |
PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 0.25 | 12-0193 | |
APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 0.25 | 47-5931 | |
FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 2.50 | 11-0453 | |
eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 1.00 | 48-0454 | |
Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 1.25 | 13-0452 | |
Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 1.25 | 13-0031 | |
Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 1.25 | 13-0112 | |
Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 1.25 | 13-5931 | |
Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 0.63 | 13-5921 | |
V500 streptavidin | BD Biosciences | 0.50 | 561419 | |
PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 0.25 | 553355 | |
PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 0.25 | 558162 | |
PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 0.50 | 46-1351 | |
Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 0.63 | 115918 | BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
1ml tuberculin syringe with 27G needle | BD Syringe | 309623 | ||
1ml tuberculin syringe with 25G needle | BD Syringe | 309626 | ||
70 um cell strainer | BD Falcon | 352350 |