Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.
Maximizando o benefício de células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs) para a investigação, modelagem doença, farmacêutica e aplicações clínicas requer métodos robustos para a produção em larga escala de tipos de células funcionais, incluindo cardiomiócitos. Aqui demonstramos que a manipulação temporal da WNT, TGF-β, e SHH vias de sinalização leva a linhas HPSC diferenciação de cardiomiócitos altamente eficiente de uma única célula passadas em ambos suspensão estática e sistemas de suspensão biorreactor agitado. Empregando esta estratégia resultou em ~ 100% de bater esferóides, contendo consistentemente> 80% de células T-positivos de troponina cardíaca após 15 dias de cultura, validados em várias linhas HPSC. Nós também um relatório sobre a variação deste protocolo para uso com linhas celulares não está adaptado para passaging de uma única célula, o sucesso do que foi verificado em 42 linhas HPSC. Cardiomiócitos gerados usando estes protocolos expressam marcadores de linhagem específica e show esperado electrophysfuncionalidades iological. Nosso protocolo apresenta uma plataforma simples, eficiente e fiável para a produção em larga escala de cardiomiócitos humanos.
As células humanas pluripotentes estaminais (hPSCs), incluindo células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs), têm a capacidade de auto-renovação e a capacidade de se diferenciar em células dos três folhetos embrionários 1,2. Devido a estas características, hPSCs fornecer uma fonte valiosa e ilimitado para a geração e escalonável de produção de tipos de células doenças relevantes para a modelagem de doenças humanas 3-5, para high-throughput screening de drogas e de toxicidade ensaios 6,7 e, potencialmente, para aplicações clínicas 8 . Geração de cardiomiócitos de hPSCs proporciona a oportunidade de investigar especificamente os mecanismos de doenças cardiovasculares humanas complexas e as suas possíveis tratamentos anteriormente, para além do âmbito dos nossos recursos devido à falta de modelos animais relevantes e / ou a disponibilidade de tecidos primários afectadas.
Todas as aplicações acima mencionadas de N hPSCsecessitate a produção de um enorme número de cardiomiócitos altamente enriquecido e funcionais. Assim, a disponibilidade de uma forma eficiente, reprodutível e escalonável protocolo in vitro diferenciação cardíaca adequada para várias linhas HPSC é crucial. Protocolos de diferenciação de cardiomiócitos convencionais têm empregado estratégias diferentes, tais como formação de corpos de embryoid 9, técnicas de co-cultura 10, indução com cocktails de citocinas 11 e métodos de transdução de proteína 12. Apesar dos avanços nestas técnicas, a maioria ainda sofrem de baixa eficiência, necessitam de fatores de crescimento caros, ou oferecer universalidade limitada ao tentar usar várias linhas HPSC. Até à data, estes desafios estabeleceram limites para a produção de cardiomiócitos HPSC derivadas de estudos de terapia celular em modelos animais, bem como na indústria farmacêutica para a descoberta de medicamentos 13. Portanto, o desenvolvimento de técnicas robustas e acessíveis para grandeprodução -scale de cardiomiócitos HPSC derivados funcionais em sistemas de cultura escaláveis seria em grande medida facilitar as suas aplicações comerciais e clínicas.
Neste artigo, é relatado o desenvolvimento de um sistema de diferenciação cardíaca custo-eficaz e integrado com uma elevada eficácia, a reprodutibilidade e a aplicabilidade para hESCs e hiPSCs gerados a partir de uma variedade de fontes e métodos de cultura, incluindo um método para a produção em larga escala de altamente populações enriquecidas de cardiomiócitos HPSC-derivadas utilizando um bioreactor. Além disso, temos aperfeiçoado este protocolo para linhas HPSC não adaptadas ao alimentador de cultura de células livres e / ou único, como hiPSCs recém-criadas ou grandes grupos de linhas HPSC relevantes para análise do mecanismo da doença.
Os cardiomiócitos derivados de hPSCs são uma fonte extremamente atraente para uso em modelagem doença humana, os testes de triagem / toxicidade do fármaco e, talvez, no futuro, as terapias de regeneração. Um dos principais obstáculos para a utilização destas células no entanto, é a capacidade de fornecer o material de alta qualidade suficiente para a sua utilização eficaz. Usando nosso protocolo descrito, oferecemos um método que supera essa limitação.
Recentemente, pequenas …
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by grants provided from Royan Institute, Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, the Iran National Science Foundation (INSF), the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC; 354400), the National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629), and the New South Wales Cardiovascular Research Network. HF was supported by a University International Postgraduate Scholarship from the University of New South Wales, Australia. RPH was supported by a NHMRC Australia Fellowship. The authors express their gratitude to the human subjects who participated in this research.
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |