Isolamento de gigante lampbrush Cromossomos de Living oócitos de rãs e salamandras
Summary
Nós apresentamos técnicas simples para isolar gigantes cromossomos lampbrush transcricionalmente ativos a partir de oócitos de rãs e salamandras vivo. Nós descrevemos como observar esses cromossomos "vivo" por contraste de fase ou contraste de interferência diferencial, e como corrigi-los para hibridação in situ fluorescente ou coloração de imunofluorescência.
Abstract
Nós descrevemos métodos para estudar os cromossomos gigantes transcricionalmente ativos lampbrush (lbcs) encontrados no oócito ou ovo unlaid, de rãs e salamandras. Lbcs individuais pode ser de até 1 mm de comprimento e que residam num núcleo gigantesca, em si até 0,5 mm de diâmetro. O grande tamanho dos cromossomas permite observações inigualáveis de genes activos por microscopia óptica de luz, mas, ao mesmo tempo técnicas especiais são necessárias para o isolamento do núcleo, retirando o envelope nuclear, e espalhando os cromossomas numa lâmina de microscópio. O núcleo do oócito, também chamado de vesícula germinal (GV), é isolado num meio que permite que a gelificação parcial da actina nuclear e preserva a estrutura delicada das lbcs. Esta etapa é efectuada manualmente, sob um microscópio de dissecação com uma pinça de joalheiro. Em seguida, o envelope nuclear é removido, mais uma vez manualmente com uma pinça de joalheiro. O conteúdo nucleares são rapidamente transferidos para um meio que disperses o gel actina e permite que os lbcs não danificados para liquidar sobre uma lâmina de microscópio. Neste ponto, os lbcs e outras organelas nucleares pode ser visto por contraste de fase ou microscopia de contraste de interferência diferencial, embora mais pequenos detalhes são obscurecidos por movimento browniano. Por observação microscópica alta resolução ou a análise molecular, toda a preparação é centrifugada para prender os delicados lbcs firmemente à corrediça. Uma breve fixação em paraformaldeído é seguida por coloração de imunofluorescência ou hibridação in situ. Lbcs estão em um estado transcricionalmente ativo e seu enorme tamanho permite a análise molecular ao nível do gene individual usando microscopia de super-resolução confocal ou.
Introduction
A maioria dos vertebrados, com a notável exceção de marsupiais e mamíferos placentários, produzem ovos grandes vitelinados. Apesar de seu tamanho, por vezes enorme, esses ovos são células isoladas que atingem a sua dimensão final, enquanto ainda no ovário da fêmea. Ovos do ovário são chamados de ovócitos e cada normalmente contém um único núcleo gigante, conhecido desde o início do século 19 como a vesícula germinal ou simplesmente GV. 1 oócitos de rãs de laboratório comuns, Xenopus laevis e Xenopus tropicalis, atingir um diâmetro máximo de 1,2 milímetros e 0,8 mm, respectivamente (Figura 1). Os GVs de oócitos maduros destes dois sapos são 0,3 – 0,4 mm de diâmetro (Figuras 2, 3). Salamandras normalmente têm oócitos e GVs ainda maiores. Oócitos totalmente maduros do axolotl mexicano, Ambystoma mexicanum, são mais de 2 mm de diâmetro eo GV é de cerca de 0,5 mm. Assim, estes núcleos são facilmente visíveis a olho nu e podeser manipulados de várias maneiras que são impossíveis com os núcleos das células somáticas típicas.
Igualmente notável é o tamanho gigantesco dos cromossomos dentro do GV, fato já reconhecido no final do século 19. Cromossomas individuais de Ambystoma e outros salamandras pode ser de até 1 mm de comprimento (Figuras 4, 5). Aqueles de Xenopus são consideravelmente menor, embora com comprimentos até 100 m ou mais, minimizam os cromossomas somáticas típicas da maioria dos organismos. Uma característica importante dos cromossomas oócito é a sua extraordinária actividade de transcrição, o que leva a um dos seus aspectos mais característicos morfológicas – centenas de malhas laterais emparelhados (Figura 5). Cada ciclo é constituído por uma ou algumas unidades de transcrição que sintetizam activamente o ARN. Os loops dar oócito cromossomos uma aparência difusa, o que levou ao nome do cromossomo "lampbrush" após a sua superficialsemelhança com as escovas usadas em épocas anteriores para limpar querosene chaminés da lâmpada. 2
O foco deste artigo é sobre o uso da GVS isoladas para estudar lbcs e organelas nucleares (nucléolo, órgãos histona de locos, e manchas). Duas técnicas bastante diferentes serão descritas. Na primeira técnica, mais comum, GVs são isolados numa solução salina utilizando uma pinça de joalheiro, brevemente enxaguados para remover gema aderente, e o envelope nuclear é removido, de novo com uma pinça de joalheiro. O conteúdo gelatinosos, contendo os lbcs e organelas nucleares, estão autorizados a resolver sobre uma lâmina de microscópio de vidro ou lamela. Tais preparações podem ser analisados directamente por microscopia de contraste de fase ou DIC. Alternativamente, as preparações podem ser centrifugadas para anexar os lbcs e organelas para o slide ou lamela. Tais preparações podem ser processadas para análise molecular detalhada de ácidos nucleicos e proteínas, principalmente por imunofluorescência e fluorescent hibridação in situ (FISH). 3-7
Uma segunda técnica envolve o isolamento de GV em óleo mineral. 8 GVs isolada-do petróleo continuam transcricionalmente ativa por muitas horas e são potencialmente úteis para estudos onde se quer o conteúdo nucleares para ser o mais realista possível. 9,10 Uma vez que o índice de refracção de o "SAP" nuclear é próxima daquela das lbcs e outros organelos nucleares (Figura 3), as técnicas de microscopia pode ser um desafio com isolado GVs-óleo.
Finalmente, por causa de seu tamanho e facilidade de manipulação, a GVS são material ideal para estudos sobre o envelope nuclear. O complexo do poro nuclear foi descrita pela primeira vez a partir de estudos de microscopia eletrônica em envelopes GV anfíbios 11 e observações SuperResolution mais recentes têm usado o mesmo material. 12,13
Protocol
Representative Results
Discussion
As primeiras observações de lbcs "vivos" de GVs isolado mão de rãs e salamandras foram feitas quase 80 anos pelo biólogo norte-americano William Duryee, 19 antes da introdução de contraste de fase e microscopia DIC, antes de imuno fluorescente, e antes de FISH. As vantagens de lbcs para investigar detalhes da estrutura dos cromossomas e transcrição ao nível do gene indivíduo necessário desenvolvimento de técnicas para prender os lbcs para lâminas de vidro, para corrigi-los de uma forma…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under award number R01 GM33397. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. J.G.G. is American Cancer Society Professor of Developmental Genetics.
Materials
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at room temperature |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16-0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µl). | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
- Purkinje, J. E. . Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. . Lampbrush Chromosomes. 36, (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C., Kay, B. K., Peng, H. B. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Vol. 36 Methods in Cell Biology , 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G. Octagonal nuclear pores. J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C., Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
