Um passo de purificação cromatográfica de Negativo<em> Helicobacter pylori</em> Neutrófilos-proteína de activação sobre-expresso em<em> Escherichia coli</em> Em Modo Batch

Helicobacter pylori (H. pylori) é uma das principais causas de gastrite e úlcera péptica. Esta bactéria também foi classificado como cancerígeno em humanos pela Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer, parte da Organização Mundial da Saúde, em 1994. Estima-se que a prevalência de H. pylori é de 70% nos países em desenvolvimento e 30-40% nos países industrializados ^1. Mesmo que a taxa de infecção de H. pylori está diminuindo nos países industrializados, a taxa de infecção de H. pylori em países em desenvolvimento ainda é alto ^2. O tratamento padrão para erradicar H. pylori consiste na administração de um inibidor da bomba de protões, IPP, e dois antibióticos, amoxicilina ou claritromicina mais metronidazole ^3. No entanto, o aumento da resistência aos antibióticos em H. pylori relacionados com a terapia de úlcera insta o desenvolvimento de novas estratégias para prevenir oR curar a infecção. O desenvolvimento de vacina preventiva e / ou terapêutica contra o H. pylori pode proporcionar uma abordagem alternativa para controlar H. pylori.

Helicobacter pylori proteína de activação de neutrófilos (HP-NAP), um importante fator de virulência do H. pylori, foi identificado pela primeira vez em extratos aquosos de H. pylori com a capacidade de activar os neutrófilos a aderir às células endoteliais e produzem espécies reactivas de oxigénio (ROS) ^4. A infiltração de neutrófilos na mucosa gástrica encontrada em H. pylori pacientes infectados com gastrite ativa pode resultar em inflamação e danos nos tecidos do estômago. Assim, HP-PNA pode desempenhar um papel patológico através da activação de neutrófilos para induzir a inflamação gástrica, o que provoca ainda mais úlcera ou H. pylori -associated doenças gástricas. No entanto, HP-NAP é um candidato potencial para aplicações clínicas ^5,6. Devido à pró imunogénica e imunomoduladorpriedades de HP-PNA, esta proteína pode ser utilizada para o desenvolvimento de vacinas, agentes terapêuticos, e ferramentas de diagnóstico. Um ensaio clínico foi conduzido para a utilização recombinante HP-NAP como um dos componentes de uma vacina contra a proteína H. pylori. Esta vacina consiste de recombinante HP-PNA, associado citotoxina-gene A (CagA), e proteínas citotoxina vacuolar A (VacA) formulado com hidróxido de alumínio e ainda tem sido demonstrado ser segura e imunogénica em humanos ^7. Além disso, a HP-NAP actua como um potente imunomodulador para desencadear T auxiliar tipo 1 (Th1) -polarized respostas imunitárias para a terapia do cancro e ⁸ para regular negativamente as respostas imunitárias mediadas por Th2 provocadas por reacções alérgicas e infecções parasitárias ^9,10. Como para o diagnóstico, com base ELISA-HP-NAP recombinante tem sido utilizada para a detecção de anticorpos séricos contra o HP-PNA em H. pylori pacientes infectados ^11. Um estudo mostrou que o nível de anticorpos específicos de HP-NAP em soros de H. pyLori pacientes infectados com carcinoma gástrico foi significativamente mais elevada do que a partir de pacientes com gastrite crónica ^12. Outro estudo também mostrou que os anticorpos séricos contra HP-PNA estão associados com a presença de não-cárdia adenocarcinoma gástrico ^13. Assim, ELISA baseado em HP-NAP recombinante pode ser utilizada para a detecção de anticorpos séricos contra o HP-PNA para o prognóstico do cancro gástrico em H. pylori pacientes infectados. Tomados em conjunto, o HP-NAP purificada pode ser ainda utilizado para a prevenção, tratamento e prognóstico do H. pylori -associated doenças, bem como a terapia do cancro.

Entre os vários métodos utilizados para a purificação do HP-NAP recombinante expressa em Escherichia coli (E. coli) na sua forma nativa relatados até agora, uma cromatograf ia de filtração em gel segundo passo de purificação envolvendo é necessária para se obter elevada pureza HP-NAP ^14-16 . Aqui, um método utilizando a cromatografia modo descontínuo com negativodietilaminoetilo (DEAE) resinas de permuta iónica é descrito para a purificação do HP-PNA sobre-expresso em E. coli com elevado rendimento e elevada pureza. Esta técnica de purificação foi baseado na ligação de proteínas e / ou que não sejam HP-PNA para a resina de impurezas da célula hospedeira. A pH 8,0, quase sem outras proteínas, exceto HP-NAP são recuperados a partir da fracção livre. Esta abordagem purificação utilizando cromatografia de troca iônica DEAE no modo negativo é simples e economia de tempo, permitindo a purificação do recombinante HP-NAP através de cromatografia de uma etapa, através da recolha da fracção livre. Além de HP-PNA, várias outras biomoléculas, tais como vírus ^17, Imunoglobulina G (IgG) ^18, hemoglobina ^19, fosfatase de proteína ^20, e factor de virulência flagelina ^21, também tem sido relatado para ser purificado por cromatografia de permuta iónica em negativo modo. O modo negativo é o preferido para a cromatografia de permuta iónica se as impurezas são o menorcomponentes presentes na amostra submetida a ser purificada ^22. A aplicação de cromatografia negativa em purificação de biomoléculas naturais ou recombinantes foi recentemente revista ^23.

O presente relatório fornece um passo a passo de protocolo para a expressão de recombinante HP-NAP em E. coli, a lise das células, e a purificação do HP-PNA utilizando cromatografia lote modo negativo com resinas de permuta iónica em DEAE. Se uma proteína desejada para a purificação é adequada para cromatografia de permuta iónica em modo negativo, o protocolo descrito também pode ser adaptado como um ponto de partida para o desenvolvimento de um processo de purificação.