צעד אחד טיהור זיהוי תכונות חומרים שלילית של<em> הליקובקטר פילורי</em> חלבון נויטרופילים-הפעלת ביתר<em> Coli Escherichia</em> במצב אצווה
Summary
שיטת תשואה גבוהה לטיהור שלילית חד-שלבית של רקומביננטי הליקובקטר פילורי חלבון ההפעלה-נויטרופילים (HP-NAP) ביתר coli Escherichia באמצעות שרפי diethylaminoethyl במצב תצווה מתואר. HP-NAP מטוהר בשיטה זו מועיל לפיתוח של חיסונים, תרופות, או אבחון עבור H. פילורי -associated מחלות.
Abstract
חלבון הליקובקטר פילורי הפעיל-נויטרופילים (HP-NAP) היא גורמת ארסיויות גדולות של הליקובקטר פילורי (H. pylori). הוא ממלא תפקיד קריטי H. פילורי -induced דלקת קיבה ידי הפעלת מספר לויקוציטים מולד כולל נויטרופילים, מונוציטים, ותאי פיטום. מאפייני immunogenic ואת המערכת החיסונית של HP-NAP הופכים אותו למועמד אבחון חיסון פוטנציאל H. פילורי ומועמד תרופה חדשה לטיפול בסרטן. על מנת לקבל כמויות ניכרות של NAP HP המטוהר המשמש ליישומים הקליניים שלה, שיטה יעילה לטהר חלבון זה עם תשואה וטוהרת גבוהות צריכה להיות הוקם.
בפרוטוקול זה, שתיארנו שיטה לטיהור chromatographic שלילית חד-שלבית של NAP HP רקומביננטי ביתר Escherichia coli (E. coli) באמצעות diethylaminoethyl (DEAE) חילופי יונים בעזרת שרפים (למשל., Sephadex) iבמצב יצווה n. HP-NAP רקומביננטי מהווה כמעט 70% של החלבון הכולל ב E. coli, והוא התאושש כמעט לחלוטין בשבריר מסיס על תמוגה התא ב- pH 9.0. תחת במצב אופטימלי ב- pH 8.0, רוב HP-NAP הוא התאושש בשבריר מאוגד בעוד חלבונים אנדוגניים מ E. coli מוסרים ביעילות על ידי שרף.
שיטת טיהור זה באמצעות כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי עם שרפי יון-חילוף DEAE מניב HP-NAP ומתפקד מ E. coli בצורתו המקורית עם תשואה וטוהר גבוהה. HP-NAP מטוהרים יכול להיות מנוצל נוספת עבור מניעה, טיפול, ופרוגנוזה של H. פילורי -associated מחלות כמו גם בטיפול בסרטן.
Introduction
הליקובקטר פילורי (H. pylori) הוא גורם עיקרי של גסטריטיס כיב פפטי. חיידק זה גם סווג קרצינוגן בבני אדם על ידי הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן, כחלק מארגון הבריאות העולמי, בשנת 1994. הערכה היא כי השכיחות של H. זיהום פילורי הוא 70% במדינות המתפתחות ו 30-40% במדינות המתועשות 1. למרות שיעור הזיהום של H. פילורי הולך ופוחת במדינות המתועשות, שיעור הזיהום של H. פילורי במדינות המתפתחות עדיין גבוה 2. הטיפול המקובל למגר H. זיהום פילורי מורכב של המינהל מעכב משאבת פרוטונים, PPI, ושני אנטיביוטיקה, clarithromycin בתוספת אמוקסיצילין או metronidazole 3. עם זאת, העלייה של עמידות לאנטיביוטיקה ב H. פילורי -related טיפול כיב קורא לפיתוח אסטרטגיות חדשות כדי למנוע or לרפא את הזיהום. פיתוח של חיסון מונע ו / או טיפולי נגד H. פילורי יכול לספק גישה חלופית לשלוט H. זיהום פילורי.
חלבון הליקובקטר פילורי הפעיל-נויטרופילים (HP-NAP), גורם ארסיויות גדולות של הליקובקטר פילורי, זוהה לראשונה בשנת תמציות מים של H. פילורי עם היכולת להפעיל נויטרופילים לדבוק לתאי אנדותל ולהפיק (reactive oxygen species ROS) 4. חדירת נויטרופילים של רירית הקיבה למצוא במאמרם של ה' pylori- חולים שנדבקו עם גסטריטיס פעיל עלול לגרום לדלקת ולנזק ברקמות של הקיבה. לפיכך, HP-NAP עשוי לשחק תפקיד פתולוגי ידי הפעלת נויטרופילים לגרום דלקת קיבה, אשר עוד גורם כיב או H. פילורי -associated מחלות קיבה. אף על פי כן, HP-NAP הוא מועמד פוטנציאלי עבור יישומים קליניים 5,6. בשל פרו immunogenic ואת המערכת החיסוניתperties של HP-NAP, חלבון זה יכול לשמש כדי לפתח חיסונים, סוכנים טיפוליים, וכלי אבחון. ניסוי קליני נערך לשימוש רקומביננטי HP-NAP כאחד המרכיבים של חיסון חלבון נגד H. פילורי. חיסון זה מורכב רקומביננטי HP-NAP, גן הקשור-cytotoxin (cagA), ו- A cytotoxin vacuolating (Vaca) חלבונים גיבש עם הידרוקסיד אלומיניום הודגמה עוד יותר כדי להיות בטוח immunogenic בבני אדם 7. כמו כן, HP-NAP משמש immunomodulator חזק כדי לעורר T מסייעים מסוג 1 (Th1) -polarized התגובה החיסונית לטיפול בסרטן 8 וכדי למטה לווסת את התגובות החיסוניות בתיווך Th2 שהושרו על ידי תגובות אלרגיות וזיהומים טפיליים 9,10. באשר אבחון, רקומביננטי HP-NAP המבוסס ELISA יושם לאיתור נוגדנים בנסיוב נגד HP-NAP ב- H. פילורי -infected חולים 11. מחקר אחד הראה כי רמת נוגדנים-NAP הספציפי של HP ב- סר מן H. pyלורי -infected בחולים עם סרטן קיבה היה גבוה משמעותית מזה של חולים עם דלקת קיבה כרונית 12. גם מחקר אחר הראה כי נוגדנים בנסיוב נגד HP-NAP המשויכים בנוכחות אדנוקרצינומה בקיבה הלא הקיבה 13. לפיכך, רקומביננטי HP-NAP המבוסס ELISA ניתן להחיל לאיתור נוגדנים בנסיוב נגד HP-NAP עבור הפרוגנוזה של סרטן קיבה אצל ח פילורי -infected חולים. יחדיו, HP-NAP מטוהרים יכול להיות מנוצל נוספת עבור מניעה, טיפול, ופרוגנוזה של H. פילורי -associated מחלות כמו גם בטיפול בסרטן.
בין מספר השיטות השתמשו לטיהור רקומביננטי HP-NAP לידי ביטוי Escherichia coli (E. coli) בצורתו המקורית שדווח עד כה, צעד טיהור שני כרומטוגרפיה ג'ל-סינון מעורב נדרש כדי להשיג מאוד טהור HP-NAP 14-16 . כאן, שיטה באמצעות כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי עםdiethylaminoethyl (DEAE) חילופי יונים בעזרת שרפים מתוארים לטיהור HP-NAP ביתר E. coli עם תשואה גבוהה וטוהר גבוה. טכניקת טיהור זו התבססה על הכריכה של חלבוני תא מארח ו / או זיהומים אחרים מאשר HP-NAP שרף. בשעת 8.0 pH, כמעט ללא חלבונים אחרים למעט HP-NAP הם התאוששו מן השבר המאוגד. גישת טיהור זה באמצעות כרומטוגרפיה יון-חילוף DEAE במצב שלילי היא פשוט חוסך זמן בכך שהוא מאפשר טיהור של HP-NAP רקומביננטי באמצעות כרומטוגרפיה צעד אחד באמצעות האיסוף של השבריר המאוגד. בנוסף HP-NAP, כמה ביומולקולות אחרים, כגון וירוסים 17, אימונוגלובולין G (IgG) 18, המוגלובין 19, phosphatase חלבון 20, ו גורם ארסיות flagellin 21, דווחו גם להיטהר על ידי כרומטוגרפיה-חילוף יונים בנגטיב מצב. המצב השלילי עדיף כרומטוגרפיה יון-חילופי אם זיהומים הם הקטיןרכיבים נוכחיים במדגם הנתון להיטהר 22. היישום של כרומטוגרפיה שלילית בטהרת ביומולקולות טבעית או רקומביננטי נבדק לאחרונה 23.
הדו"ח הנוכחי מספק צעד אחר צעד פרוטוקול עבור ביטוי רקומביננטי HP-NAP ב E. coli, תמוגה של התאים, וטיהור-NAP HP באמצעות כרומטוגרפיה יצווה מצב שלילי עם שרפי יון-חילוף DEAE. אם החלבון הרצוי לטיהור מתאים כרומטוגרפיה-חילוף יונים במצב שלילי, פרוטוקול המתואר יכול גם להיות מותאם כנקודת מוצא לפיתוח של תהליך טיהור.
Protocol
Representative Results
Discussion
כרומטוגרפיה תצווה המצב השלילית עם שרפים-אניוני DEAE המוצגת כאן היא מתאימה טיהור רקומביננטי HP-NAP ביתר coli E. ערכי ה- pH של המאגרים המשמשים מדרגות תמוגה תא וטיהור מאוד קריטיים כדי להבטיח את המסיסות של HP-NAP ב E. lysates coli ו הפרדה יעילה של-NAP HP רקומביננטי מן הטומאות הת…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).
Materials
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate | Bio‐Rad | 500-0006 | for protein quantitation http://www.bio-rad.com/en-us/sku/5000006-bio-rad-protein-assay-dye-reagent-concentrate |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
References
- Brunette, G. W., et al. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. , (2015).
- Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157 (2011).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection–the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
- Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
- de Bernard, M., D’Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe?. Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
- Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
- Del Prete, ., G, , et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
- Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
- Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
- Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
- Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection–novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
- Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
- Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
- Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
- Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
- Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
- Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
- Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
- Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
- Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
- Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
- Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
- Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
- Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing ‘silent’ restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).
