Un passo negativo cromatografica Purificazione di<em> Helicobacter pylori</em> Neutrofili-attivazione della proteina sovraespresso in<em> Escherichia coli</em> In modalità batch

Helicobacter pylori (H. pylori) è una delle principali cause di gastrite e ulcera peptica. Questo batterio è stato classificato come sostanza cancerogena per l'uomo dall'Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro, che fa parte dell'Organizzazione Mondiale della Sanità, nel 1994. E 'stato stimato che la prevalenza di H. pylori è del 70% nei paesi in via di sviluppo e il 30-40% nei paesi industrializzati ^1. Anche se il tasso di infezione di H. pylori è in calo nei paesi industrializzati, il tasso di infezione di H. pylori nei paesi in via di sviluppo è ancora alto ^2. Il trattamento standard per sradicare H. pylori consiste nella somministrazione di un inibitore della pompa protonica, PPI, e due antibiotici, claritromicina più amoxicillina o metronidazolo ^3. Tuttavia, l'aumento della resistenza agli antibiotici in H. pylori -related terapia dell'ulcera sollecita lo sviluppo di nuove strategie per prevenire or curare l'infezione. Sviluppo di vaccinazione preventiva e / o terapeutico contro H. pylori potrebbe fornire un approccio alternativo per controllare H. pylori.

Helicobacter pylori neutrofili-attivazione di proteine ​​(HP-NAP), un importante fattore di virulenza di H. pylori, è stato identificato in estratti di acqua di H. pylori con la possibilità di attivare neutrofili di aderire alle cellule endoteliali e produrre specie reattive dell'ossigeno (ROS) ^4. Infiltrazione dei neutrofili della mucosa gastrica si trovano in H. pylori pazienti infettati con gastrite attiva possono provocare infiammazione e danni ai tessuti dello stomaco. Così, HP-NAP può giocare un ruolo patologico attivando neutrofili per indurre infiammazione gastrica, che provoca ulteriore ulcera o H. pylori -associated malattie gastriche. Tuttavia, HP-NAP è un potenziale candidato per le applicazioni cliniche ^5,6. A causa della pro immunogenica e immunomodulanteprietà di HP-NAP, questa proteina potrebbero essere utilizzati per sviluppare vaccini, agenti terapeutici, e strumenti diagnostici. Uno studio clinico è stato condotto per l'utilizzo ricombinante HP-NAP come uno dei componenti di un vaccino contro H. proteine pylori. Questo vaccino è costituito da ricombinante HP-NAP, cytotoxin associata gene A (CagA), e le proteine ​​vacuolizzante citotossina A (VacA) formulato con idrossido di alluminio ed è stato ulteriormente dimostrato di essere sicuro ed immunogenico negli esseri umani ^7. Inoltre, HP-NAP agisce come un potente immunomodulatore per innescare T helper di tipo 1 (Th1) -polarized risposte immunitarie per la terapia del cancro ⁸ e per regolare le risposte immunitarie Th2-mediate indotte da reazioni allergiche e infezioni parassitarie ^9,10. Per quanto riguarda la diagnostica, ricombinante ELISA HP-NAP-based è stata applicata per rilevare gli anticorpi sierici contro HP-NAP in H. pylori -infected pazienti ^11. Uno studio ha mostrato che il livello di anticorpi specifici per HP-NAP nei sieri di H. pylori -infected pazienti con cancro gastrico è risultata significativamente più alta di quella di pazienti con gastrite cronica ^12. Un altro studio ha anche dimostrato che gli anticorpi sierici contro HP-NAP sono associati con la presenza di non-cardias adenocarcinoma gastrico ^13. Così, ricombinante ELISA HP-NAP-based può essere applicata per rilevare anticorpi contro HP-NAP per la prognosi del cancro gastrico in H. pylori -infected pazienti. Nel loro insieme, la HP-NAP purificata potrebbe essere ulteriormente utilizzato per la prevenzione, il trattamento e la prognosi di H. pylori -associated malattie e terapia del cancro.

Tra i vari metodi utilizzati per la purificazione di ricombinante HP-NAP espresso in Escherichia coli (E. coli), nella sua forma nativa, presentate finora, una cromatografia di gel-filtrazione seconda fase di purificazione che coinvolge è necessario per ottenere elevata purezza HP-NAP ^14-16 . Qui, un metodo che utilizza negativo cromatografia modalità batch condietilamminoetil (DEAE) resine a scambio ionico è descritto per la purificazione di HP-NAP sovraespresso in E. coli con alto rendimento e di elevata purezza. Questa tecnica di purificazione è stata basata sul legame di proteine ​​della cellula ospite e / o impurezze diverse HP-NAP alla resina. A pH 8,0, quasi senza altre proteine ​​tranne HP-NAP vengono recuperati dalla frazione non legata. Questo approccio purificazione mediante DEAE cromatografia a scambio ionico in modalità negativa è semplice e risparmio consentendo purificazione ricombinante HP-NAP tramite one-step cromatografia attraverso la raccolta della frazione libera tempo. Oltre ad HP-NAP, diverse altre biomolecole, come virus ^17, Immunoglobulina G (IgG) ^18, emoglobina ^19, proteina fosfatasi ^20, e fattore di virulenza flagellin ^21, sono stati segnalati anche ad essere purificata dalla cromatografia a scambio ionico in negativo modalità. La modalità negativa è preferito per cromatografia a scambio ionico se impurità sono il minorecomponenti presenti nel campione sottoposto da depurare ^22. L'applicazione della cromatografia negativo purificazione di biomolecole naturali o ricombinanti è stato recentemente rivisto ^23.

Il presente rapporto fornisce un passo per passo il protocollo per l'espressione ricombinante HP-NAP in E. coli, la lisi delle cellule, e purificazione di HP-NAP utilizzando modalità negativa cromatografia batch con resine a scambio ionico DEAE. Se una proteina desiderata per purificazione è adatto per cromatografia a scambio ionico in modo negativo, il protocollo descritto potrebbe anche essere adattato come punto di partenza per lo sviluppo di un processo di purificazione.