We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.
我々は現在の自己組織化の研究を可能にする胚様体(EB)の文化、対称性の破れ、軸方向伸長および懸濁培養でマウス胚性幹細胞(たmESC)の集合体を用いて細胞の運命の仕様を改善プロトコルを開発しました。たmESCの少数は、それらが実験的シグナルに応答する能力があるその後、非組織培養処理された、U底96ウェルプレートで48時間基礎培地に集約されます。処理後、これらの凝集体は、偏遺伝子発現の兆しを見せ、徐々に外部非対称性の手がかりのない状態で細長い、よく組織構造への細胞の球状の塊から、その形態を変えるために始めます。これらの構造だけでなく、三胚葉のマーカーを表示することができますが、積極的に決定的に細長い構造の一つの領域で発生する骨材からの個々の細胞の方向性脱落によって証明原腸陥入のような動きを、表示します。このprotocオールは、これらの凝集体の再現性の形成、などのWnt /βカテニンの活性化及びBMP阻害および単一の時点またはタイムラプス蛍光顕微鏡によるそれらの分析などの信号との刺激のための詳細な方法を提供します。さらに、当社は固定凝集体内の特異的マーカーの免疫細胞化学分析のための現在の全体のマウントマウス胚染色手順の変更について説明します。凝集体の形態、遺伝子発現及び長さの変化を定量的シグナルが、軸方向の運命を変えることができる方法についての情報を提供し、測定することができます。これは、このシステムは、このような軸方向の開発や組織として初期発生事象の研究の両方に適用され得ることが想定され、より広範に、自己組織化および細胞の意思決定のプロセス。それはまた、脊髄および運動ニューロンのような従来の接着培養から得られないある胚に存在する細胞型の生成に適したニッチを提供することができます。
初期の哺乳類の発生における細胞運命決定の研究と理解は胚性幹細胞(ESC)の文化、自己更新し、生物、すなわち 、すべての細胞型に分化する能力を持つ胚盤胞由来クローン集団を利用することができます。、彼らは多能性1,2です。これらの培養物がされていると細胞運命決定の分子基盤を理解するために有用であることが継続しているが、それらは原腸形成中の胚で生成された空間的配置とグローバル行動の一部を再現することはできません。胚では、原腸形成のプロセスは、3つの異なる胚葉に単一上皮層を変換し、明白な前後組織3-5で胚を付与します。 ex vivoでこれらのイベントを再現しようとする試みは、ESCの三次元凝集体の発生に基づいて、胚様体(EB)と呼ばれ、それらにTを施すされていますO分化条 件6,7。これらの凝集体は、いずれかの得られるか、または誘導された低効率で接着培養または全く製造できないことができないいくつかは、多くの異なる細胞型に分化するようになだめすることができる; 例えば 、血液8および始原生殖細胞9。 EBの使用には制限がしかし、空間的な崩壊6,10で、その結果、発生中の胚の主要な特性であること胚葉分布や軸方向の組織、彼らは形態形成の動作を表示することができないということです。ある報告では、WntとEBの治療は、いくつかの集合体における遺伝子発現の弱い分極につながるが、明確な形態形成は7を観察されません。より最近の報告では、長期間にわたって培養されたEBは、その胚の対応を模倣するように網膜、皮質および内耳感覚細胞として前部構造を開発するが、軸方向のorganizatのコンテキストなし開発しますイオン11-13。
Marikawa らの報告14は 、ハンギングドロップ法により形成されたマウスP19胚性癌(EC)細胞の集合体で作業しながら、両生類でexogastrulaeで観察された伸びを思わせる中胚葉起源の細長い構造の出現を報告しましたウニ胚とケラー植15-18。これはマウス胚性幹細胞(たmESC)で観察されていなかったとして、我々はたmESC 19の集合体を使用して、P19 EC細胞で観察された現象を再現しようとしたと我々は彼らの対称性の破れと軸方向の伸びにつながる培養条件を報告します。 P19細胞を用いた作業の重要な違いは、ここで説明する集約プロトコルが代わりに懸滴の、永楽ら 20によって記載されたものと同様の96ウェルプレートで行われることです。この変更は、集約回復の観点との両方で効率の向上をもたらしました内および実験間の再現性。重要なことは、個々のウェルに凝集体を維持することは、凝集体(懸滴から共通プール集合体)との間の融合が生じないことを保証します。また、プロトコルの重要な特徴は以下の集約、GSK3阻害剤CHI99021(カイ)、Wnt /βカテニンシグナル伝達の強力な活性化への24時間の暴露です。
ここで説明する方法は、推論がインビボ19,21 の軸開発に関して行わできるようにすること、文化の中で自己組織化のプロセス、軸組織および生殖層の仕様を理解するための基礎を提供します。これらの理由のための方法は、胚で勉強することが困難な場合があるプロセスの詳細なメカニズムの分析を可能にする可能性を有します。さらに、潜在的なアプリケーションが原因のような構造化された細胞のニッチの欠如に接着培養で容易に得ることができない組織や器官の世代であり、脊髄は21とモータニューロンを前駆体です。三次元集約文化が空間的に組織的に胚系統の誘導のための新しいアプローチにつながる、従来の手段によって達成可能ではないかもしれない物理的な構造およびシグナリング環境を提供しています。
この原稿に記載された技術は、効率的かつ再現Marikawa らハンギングドロップ培養の両方を組み合わせたマウス胚性幹細胞(たmESC)そのディスプレイに編成対称破りと伸び19の凝集体を生成します。14、EB形成。これらの凝集体は、視神経カップ11と大脳皮質13としてES細胞から前方器官の生成のための既存の方法を補完する、軸方向の伸びを開発するために行くと、原腸形成中と同様の表示処理3胚葉のアイデンティティと細胞を含みますこのような急速な細胞運動19,21として。
それは外部のパターニング組織が 存在しない場合に発生し、接合体非対称性が19を頭出しするので、それは、対称破りのイベントの性質を推測することは興味深いです。初歩的な軸の自発的な形成は、既存のheterogenから発生する可能性が非対称の開発のための基礎を形成する細胞の出発培養物中eities。実際、ESLIF条件で培養した細胞の集団は、1つの集約によって異なる可能性があるの相対的な割合を自己複製と分化する細胞の混合物を表示します。また、私たちの研究室での準備作業は、細胞の完全に多能性集団から凝集体が(DAターナー&準備中A.マルティネスアリアス、)組織化パターン形成における不均一性の役割を示唆し、パターニングにおける遅延開発や欠陥を示すことを示唆しています。これは、反応拡散機構離れ骨材の表面からの阻害剤の拡散と、パターンを生成することができることを考えるとも価値があります。 Warmflash ら 41は 、このようなメカニズムが三次元でパターニングのための可能な候補作り、接着培養で放射状非対称性を開発するための責任であることを示唆しています。
イニシア中にL 48時間の集計期間は、細胞は、二次媒体19,21,24からのシグナルに応答する能力である、着床後の胚盤葉上層、内と同様の状態に達します。一般的に、ここで説明するプロトコルは、伸長のための十分な信号を提供する(例えばWntシグナル/βカテニンアゴニストなど)の要因が含まれている二次媒体のパルスで細胞を提供します。凝集細胞がオンするためのマトリゲル滴に移した前アル前ランカスターら培養方法。(ヒトESC 13を使用)、永楽ら。(たmESC 11を有する)は、低接着性の96ウェルプレート中で凝集の短い期間を使用し文化を行きます。凝集およびマトリゲル挿入の間の時間は、研究の間で異なったが、両方の場合において、多数の細胞を凝集体形成(約3,000-4,500細胞)のために使用しました。対照的に、プロトコル19ははるかに少ない細胞(約400細胞を使用してここに記載さ)集合当たりの伸長、対称性破壊及び19で観察された偏光の過程に不可欠であることが決定されています。また、これらの細長い構造は人工のマトリックス中に埋め込 むことなく、はるかに短い時間周期で生成することができます:ランカスターらによって定義された脳領域の生成を比較する(> 20〜30日)永楽から13と、光学カップ。ら(〜11日)、11偏細長い構造の生 成に必要な5日間です。
しかし、ここで説明する培養方法と制限の1つは、その大きさは井戸の底に沈むと非にでも接着性を強制するために、重力の下でそれらが有能なレンダリングまで、彼らは唯一のメッキポスト約5〜6日間培養することができるということですコーティングされたプラスチックウェア。 、先に述べたもののような人工のマトリックスを用いたさらなる実験は、私たちはの期間を長くすることを可能にします観察と実験、ワークオン行くように集合体を拘束する効果を決定することです。この技術のさらなる限界は、凝集物を除去することなく、メディアを変更するために、培地の少量をウェルの底に残さなければならないことです。化学遺伝学のための結果は、アプローチは、この希釈し、前のメディアからの残留効果を検討する必要がある:3μMチーパルスの日に、2.37μM溶液を実際に配信し、その後のメディアの変更は0.499のキャリーオーバーが生じていますμM(72〜96時間)と時間の点の間の0.105μM(96から120時間)。現在の仕事は、希釈のために修正されていない、それは日常の中の変更が残留効果を最小限にすることを想定しています。
内および実験間の再現性の両方を確保するためのプロトコルにおける重要なステップの数があります。まず、たmESCの出発培養物は十分に維持されていない共同オーバーする必要がありますnfluent、および媒体は常に良い品質、すなわちである必要があります。、新鮮でよく混合( 図5A、B)。悪い培養条件は不利に集約( 図5Bi)に影響を与えます 。 〜400セル/ 40μlの細胞懸濁液を得るための細胞の正確なカウントより大きな凝集体は、自己組織化に失敗し、各ウェル内の二重凝集体を形成する可能性が高いように、必要不可欠である( 図5Bii)より小さな凝集体は正しいに到達することができないのに対し、彼らは刺激( 図5Biii)に対応することができます密度。重要な最適化ステップは、細胞懸濁液からの汚染物質の血清を除去する第二のPBS洗浄(2.6ステップ)を含めることでした。これは、集計頻度が向上し、約24時間までに集合体の開発を加速させました。次に、確実に媒体の変更がウェルの表面に付着する可能性がある任意の凝集物を除去するのに十分な力が印加されます。そうRESUを行うに失敗骨材「クラッシュ」でLTS( 図5Biv)。さらに、以前に言及した(以下)としては、凝集体は、懸濁培養中に維持され、任意の表面に付着することが防止されることを保証することが不可欠です。凝集物が付着したら、遺伝子発現及びその伸びの可能性のパターンが破壊されます。
この技術は、比較的簡単で、かつ十分に良好な組織培養技術を有する個体の任務の範囲内にあるように、凝集に関連する問題の多くは、比較的迅速に、これらの重要なステップに従っている場合に解決することができます。トラブルシューティングの完全なテーブル(表1)が利用可能です。マスターと、この技術は、軸開発、対称性破壊および細胞決定イベントを研究するために使用することができます。具体的には、これらの凝集体は、脊髄およびモトとしてこれまで培養物中で利用できなかった細胞のプールを生成する可能性を有しますr個のニューロン。
倫理注:これは、ヒトESやiPS細胞培養物へのこのプロトコルの翻訳はヒト胚の研究、原始線条の、すなわち世代の14日の制限の法的根拠に近い実験をもたらすことができることにより、慎重に注意すべきです、ヒト受精胚研究法と2008(英国)42で説明するように。同法に関係なく、作成した方法のすべてのライブ人間の胚をカバーしているので、ステージのような原始的ストリークを超えた人間gastruloidsの文化は、ライセンス供与研究の範囲を越えています。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、AMA、PB-Jとエラスムス、ステフティングのDRにEPSRCの学生の身分にウェルカム・トラストからプロジェクト無償の貢献でAMAにERC高度な研究者賞(DAT、TB)によって運営されています。ヘンドリックミュラーのVaderlandschフォンとFundatieバン・デ・VrijvrouweバンRenswoude TEの-Gravenhage SCvdBします。我々は彼らの実験室のプロトコルを共有するためのJ・ブリスコー、S・ムニョス・デスカルツォ、C.シュレーター、およびT.ロドリゲス、議論や建設的な批判のために、ホアキン・デNavascués封入プロトコルおよびAK HadjantonakisとC Budjan両方に感謝したいと思いますホールマウント胚の染色に関連します。この記事の以前のバージョンは、以前bioRxivプレプリントサーバ29上で利用できるようになりました。
2-Mercaptoethanol | Gibco/Invitrogen | 31350-010 | |
25cm2 Cell Culture Flask | Grenier Bio-one | 690 175 | |
Benchtop Centrifuge | MSE | MSB020.CX1.5 | |
BES Buffered Saline (BBS) | Sigma-Aldrich | B2891 | BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl |
Centrifuge tubes (15 or 50ml) | Greiner Bio-One | 118271 or 227261 | |
CHIR 99021 (Chi) | CSCR | n/a | Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10mM in DMSO |
Dissection Well (30mm Internal Diameter) | Fisher Scientific | 12678586 | |
ESLIF | 500 mL GMEM, 5mL Sodium Pyruvate, 5 mL Non-Essential Amino Acids, 5 mL Glutamax, 1 mL beta-mercaptoethanol, 50 mL FBS and 550 µL LIF (1000 units). | ||
Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use. |
Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Improved Neubauer Haemocytometer | Hawksley | AS1000 | |
Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant | CSCR | n/a | Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. |
n-Propyl-gallate | Sigma-Aldrich | 02370 | |
N2B27/NDiff 227 | Stemcells, Inc. | SCS-SF-NB-02 | http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff |
Non-Essential Amino Acids | Gibco/Invitrogen | 11140-035 | |
Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | With Calcium and Magnesium |
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-039 | |
Sterile Reservoir | STARLAB | E2310-1010 | |
Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate | Grenier Bio-one | 650185 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |