جيل من مجاميع من الفأر الخلايا الجذعية الجنينية التي تظهر التماثل يكسر، الاستقطاب والسلوك الجماعي الناشئ<em> في المختبر</em
Summary
We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.
Abstract
قمنا بتطوير بروتوكول تحسين الحالية مضغي الجسم (EB) الثقافة التي تسمح للدراسة التنظيم الذاتي، والتماثل كسر، واستطالة المحورية ومواصفات مصير الخلية باستخدام مجاميع من الخلايا الجذعية الجنينية (mESCs) في الثقافة تعليق. يتم تجميع أعداد صغيرة من mESCs في المتوسط القاعدية لمدة 48 ساعة في لوحات 96-جيدا معاملة غير الأنسجة الثقافة، U القاع، وبعد ذلك هم أكفاء للرد على الإشارات التجريبية. بعد العلاج، وهذه المجاميع تبدأ تظهر علامات الاستقطاب التعبير الجيني وتغيير تدريجيا التشكل من كتلة كروية من الخلايا ل، هيكل منظم بشكل جيد ممدود في غياب إشارات التباين الخارجية. هذه الهياكل ليست فقط قادرة على عرض علامات الطبقات الجرثومية الثلاث، ولكن بنشاط عرض الحركات الشبيهة تكون المعيدة، يتضح من الخلع الاتجاه من الخلايا الفردية من مجموع المباراتين، والذي يحدث بشكل حاسم في منطقة واحدة من هيكل ممدود. هذا protocيوفر رأ طريقة مفصلة لتشكيل استنساخه من هذه المجاميع، والتحفيز مع إشارات مثل تفعيل WNT / β-Catenin وBMP تثبيط وتحليلها من قبل واحدة الوقت نقطة أو الوقت الفاصل بين فلوري المجهر. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف تعديلات على إجراءات الجنين تلوين كامل جبل الماوس الحالية لتحليل immunocytochemical من علامات محددة ضمن المجاميع الثابتة. التغييرات في مورفولوجية والتعبير الجيني وطول المجاميع يمكن قياسها كميا، وتوفير المعلومات حول كيفية إشارات يمكن أن يغير مصير المحورية. ومن المتوقع أن هذا النظام يمكن تطبيقه على حد سواء لدراسة أحداث التنموية في وقت مبكر مثل تطوير محوري والتنظيم، وعلى نطاق أوسع، وعمليات التنظيم الذاتي واتخاذ القرارات الخلوية. وقد تقدم مكانة مناسبة لتوليد أنواع الخلايا الموجودة في الجنين التي لا يمكن الحصول عليه من ثقافة ملتصقة التقليدية مثل الحبل السري والخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري.
Introduction
دراسة وفهم القرارات خلية مصير في التنمية الثدييات المبكرة يمكن الاستفادة من الثقافات من الخلايا الجنينية الجذعية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية)، والسكان نسيلي المستمدة من الكيسات الأريمية التي لديها القدرة على الذات تجديد وتميز في جميع أنواع الخلايا في كائن حي أي.، فهي 1،2 المحفزة. في حين كانت هذه الثقافات، وستستمر في أن تكون مفيدة لفهم الأساس الجزيئي للقرارات الخلية مصير، أنهم غير قادرين على إعادة إنتاج بعض الترتيبات المكانية والسلوكيات العالمية التي يتم إنشاؤها في الأجنة أثناء تكون المعيدة. في الجنين، فإن عملية تكون المعيدة تحول طبقة واحدة الظهارية في الطبقات الجرثومية الثلاث المتميزة ويمنح الجنين مع منظمة الأمامي الخلفي العلنية 3-5. وقد وضعت محاولات لتلخيص هذه الأحداث خارج الجسم على توليد المجاميع ثلاثية الأبعاد من المجالس الاقتصادية والاجتماعية، ويشار إلى الهيئات مضغي باسم (EBS)، وتعريضهم رس ظروف التمايز 6،7. هذه المجاميع يمكن أقنع على التمايز إلى العديد من أنواع مختلفة من الخلايا، وبعضها إما غير قادرين على الحصول عليها أو التي يسببها مع انخفاض الكفاءة في ثقافة ملتصقة أو لا يمكن أن يتم إنتاجها على الإطلاق؛. على سبيل المثال، الدم 8 والجرثومية البدائية خلايا 9. وجود قيود على استخدام EBS ومع ذلك، هو أنهم غير قادرين لعرض السلوك تخلقية، توزيع طبقة الجرثومية أو منظمة المحورية التي هي الخصائص الرئيسية للالجنين النامي، مما أدى إلى سوء التنظيم المكاني 6،10. في تقرير واحد، وعلاج EBS مع WNT يؤدي إلى الاستقطاب ضعيفة في التعبير الجيني في بعض المجاميع ولكن يتم احترام أي التشكل واضح 7. المزيد من التقارير الأخيرة، EBS التي تم تربيتها لفترات طويلة من الزمن في تطوير الهياكل الأمامية مثل شبكية العين، القشرة والخلايا الحسية الأذن الداخلية، والتي تحاكي نظيراتها الجنينية ولكن تتطور دون سياق تنظيم، محوريأيون 11-13.
وقال تقرير ماريكاوا وآخرون 14، بينما تعمل مع مجاميع من الماوس P19 الأجنة سرطان (EC) الخلايا التي شكلتها طريقة اعدام الإفلات، حسبما ذكرت وظهور هياكل ممدود من أصل أرومية متوسطة تذكرنا الاستطالة التي لوحظت مع exogastrulae في البرمائيات والأجنة قنفذ البحر وكيلر إإكسبلنتس 15-18. وبما أن هذا لم وحظ مع الماوس الجنينية الخلايا الجذعية (mESCs)، حاولنا إعادة إنشاء السلوك لاحظ مع P19 خلايا EC باستخدام الركام من mESCs 19 ونفيدكم الظروف والثقافة التي تؤدي إلى التماثل على كسر ومحوري استطالة. فارق هام من العمل مع الخلايا P19 هو أن البروتوكول تجميع الموصوفة هنا يتم تنفيذ في لوحة 96-جيدا، مماثلة لتلك التي وصفها Eiraku وآخرون 20، بدلا من شنقا قطرات. أدى هذا التغيير في زيادة كفاءة من حيث الانتعاش الكلي وفي كل منداخل وبين تجريبي التكاثر. الأهم من ذلك، الحفاظ على المجاميع في الآبار الفردية يضمن أن الاندماج بين الركام (شيوعا عند تجميع الركام من قطرات شنقا) لا يحدث. بالإضافة إلى ذلك، سمة رئيسية من البروتوكول هو 24 ساعة من التعرض للCHI99021 GSK3 المانع (تشي)، منشط قوي للWNT / β-Catenin الإشارات، بعد التجميع.
الطريقة الموصوفة هنا يوفر أساسا لفهم عمليات التنظيم الذاتي، والتنظيم المحوري والجرثومية طبقة المواصفات في الثقافة، والسماح الاستدلالات إلى بذل المتعلقة بالتنمية المحورية في الجسم الحي 19،21. لهذه الأسباب الأسلوب لديه القدرة على إجراء تحليل مفصل الآلية من العمليات التي قد يكون من الصعب للدراسة في الجنين. وعلاوة على ذلك، تطبيق المحتمل في توليد الأنسجة والأعضاء التي لا يمكن الحصول عليها بسهولة في ثقافة ملتصقة نظرا لعدم وجود محراب الخلوية المهيكلة مثلالحبل الشوكي سلائف 21 والحركية الخلايا العصبية. ثقافة الإجمالية ثلاثي الأبعاد يوفر الهيكل المادي والبيئة مما يشير إلى أن قد لا تكون قابلة للتحقيق بالوسائل التقليدية، مما يؤدي إلى اتباع نهج جديد لاشتقاق الأنساب الجنينية بطريقة نظمت مكانيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنية الموضحة في هذه المخطوطة بكفاءة وبتكاثر يولد مجاميع من الخلايا الجذعية الجنينية (mESCs) التي نظمت العرض التماثل كسر واستطالة 19، والجمع بين كل من ثقافة الإفلات شنقا صفها ماريكاوا وآخرون 14 و EB تشكيل. هذه المجاميع على المضي قدما لتطوير الاستطالة المحورية، واستكمال الطرق الحالية لتوليد أجهزة الأمامي من خلايا ES مثل أكواب البصرية (11) والقشرة المخية 13، وتحتوي على خلايا مع هويات الطبقات الثلاث الجرثومية التي عمليات مماثلة لتلك أثناء تكون المعيدة العرض مثل السريع 19،21 حركة الخلية.
ومن المثير للاهتمام للمضاربة على طبيعة الحدث التماثل كسر، لأنه يحدث في غياب الأنسجة الزخرفة الخارجية والتباين اقحي جديلة. 19. تشكيل عفوية من محور بدائية يمكن أن تنشأ من قبل القائمة heterogeneities في الثقافة بدءا من الخلايا، التي تشكل الأساس لتطوير التماثل. في الواقع، السكان من الخلايا المستزرعة في ظروف ESLIF عرض خليط من تجديد الذات والتفريق الخلايا، نسب والتي قد تختلف من تجميع واحد إلى آخر. وعلاوة على ذلك، والعمل الأولي في المختبر لدينا تشير إلى أن مجاميع من السكان المحفزة كليا من الخلايا تظهر التنمية والعيوب تأخر في الزخرفة، مما يشير إلى دور لعدم التجانس في تشكيل نمط المنظم (DA تيرنر & A. مارتينيز أرياس، قيد الإعداد). ومن الجدير بالنظر إلى أن آلية تفاعل نشرها قد تولد نمط، مع نشر المانع بعيدا عن سطح مجموع المباراتين. Warmflash وآخرون. 41 تشير إلى أن هذه الآلية يمكن أن تكون مسؤولة عن وضع التماثل الشعاعي في ثقافة ملتصقة، مما يجعله مرشحا محتملا للتنميط في ثلاثة أبعاد.
خلال initiaل 48 ساعة فترة التجميع، خلايا تصل إلى حالة مماثلة لتلك التي في الأديم الظاهر postimplantation، التي هي المختصة للرد على إشارات من المتوسط الثانوي 19،21،24. عادة، وبروتوكول الموصوفة هنا يوفر الخلايا مع نبض المتوسطة الثانوية التي تحتوي على العوامل (مثل منبهات WNT / β-Catenin) التي توفر إشارات كافية لاستطالة. أساليب الثقافة السابقة التي وصفها لانكستر وآخرون. (باستخدام المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان 13) وEiraku وآخرون (مع mESCs 11) تستخدم فترة قصيرة من التجميع في البلدان المنخفضة التصاق الصفائح 96-جيدا قبل نقل الخلايا مجمعة لقطرات Matrigel لعلى- الذهاب الثقافة. على الرغم من أن الوقت بين تجميع وMatrigel الإدراج كان مختلفا بين الدراسات، في كلتا الحالتين، تم استخدام أعداد كبيرة من الخلايا لتشكيل الكلي (حوالي 3،000-4،500 الخلايا). على النقيض من ذلك، وصفت بروتوكول هنا 19 يستخدم عدد أقل بكثير من الخلايا (حوالي 400 الخلايافي مجموع المباراتين) التي تم تحديدها على أنها ضرورية للغاية لعملية استطالة، والتماثل كسر والاستقطاب الذي لوحظ 19. بالإضافة إلى ذلك، هذه الهياكل ممدود هي قادرة على أن ولدت في فترة زمنية أقصر بكثير دون التضمين في المصفوفات الاصطناعية: مقارنة جيل من مناطق الدماغ التي تحددها لانكستر وآخرون (> 20-30 يوما) 13 والبصرية أكواب من Eiraku. وآخرون. (~ 11 أيام) 11 مع 5 أيام المطلوبة لتوليد هياكل ممدود الاستقطاب.
واحدة من قيود مع أسلوب الثقافة الموصوفة هنا ومع ذلك، هو أنها لا يمكن إلا أن يكون مثقف ما يقرب من 5-6 أيام بعد انتهاء الطلاء حتى يجعل حجمها لهم مختصة بموجب خطورة لتنزل الى قاع الآبار وفرض التصاق حتى على غير المغلفة البلاستيكية وير. مزيد من التجارب باستخدام المصفوفات الاصطناعية مثل تلك المذكورة سابقا، قد تسمح لنا بزيادة فترةالملاحظة والتجريب، والعمل هو تحديد آثار تقييد الركام بطريقة مستمرة. وجود قيود مزيد من هذه التقنية هو أنه من أجل تغيير المتوسطة دون إزالة الركام، يجب أن تترك كمية صغيرة من المتوسط في قاع البئر. النتائج المترتبة على نهج الوراثة الكيميائية هي الحاجة إلى النظر في هذا التخفيف وأي آثار متبقية من وسائل الاعلام السابق: في يوم 3 ميكرومتر تشي النبض، ويتم تسليم 2.37 ميكرومتر الحل في الواقع، والتغيرات المتوسطة اللاحقة يؤدي إلى ترحيل 0،499 ميكرومتر (72-96 ساعة) و0.105 ميكرومتر (96-120 ساعة) بين نقاط الوقت. لم تصحيح العمل الحالي لتخفيف ويفترض أن التغيرات المتوسطة اليومية وتقليل الآثار المتبقية.
هناك عدد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول لضمان إعادة الإنتاج على حد سواء داخل وبين التجريبية. أولا، ثقافة ابتداء من mESCs يجب صيانتها جيدا وليس على المشتركnfluent، والمتوسطة يجب أن تكون دائما جيدة أي جودة، الطازجة وتمتزج جيدا (الشكل 5A، B). شروط الثقافة الفقيرة يؤثر سلبا على التجميع (الشكل 5Bi). عد دقيقة من الخلايا للحصول على تعليق خلية ~ 400 خلية / 40 ميكرولتر أمر ضروري، كما فشلت المجاميع الكبيرة في تقرير المصير، تنظيم وهم أكثر عرضة لتشكيل المجاميع مزدوجة داخل كل بئر (الشكل 5Bii) في حين المجاميع الصغيرة غير قادرة على الوصول الصحيح الكثافة حيث أنها قادرة على الاستجابة لحافز (الشكل 5Biii). وكانت الخطوة الأمثل الرئيسية إدراج غسل PBS الثاني الذي يزيل المصل الملوثات من تعليق خلية (الخطوة 2.6)؛ هذا تحسن وتيرة التجميع وتسارع تطور المجاميع قبل ما يقرب من 24 ساعة. بعد ذلك، يتم تطبيق التغييرات ضمان المتوسطة مع قوة كافية لطرد أي المجاميع التي لديها القدرة على الانضمام إلى سطح البئر. الفشل في القيام بذلك دورة الفتشوبLTS في "تحطمها" المجاميع (الشكل 5Biv). وبالإضافة إلى ذلك، وكما ذكر سابقا (وأدناه)، فمن الضروري لضمان أن المجاميع يتم الاحتفاظ في الثقافة تعليق ومنعت من الانضمام إلى أي سطح. مرة واحدة انضمت المجاميع، تتعطل نمط التعبير الجيني وإمكانيات استطالة بهم.
لأن هذا الأسلوب هو بسيطة نسبيا، وكذلك ضمن اختصاص الأفراد مع تقنيات زراعة الأنسجة جيدة، معظم المشاكل المرتبطة التجميع يمكن حلها بسرعة نسبيا إذا ما اتبعت هذه الخطوات الحاسمة. الجدول الكامل من المتاعب اطلاق النار يتوفر (الجدول 1). مرة واحدة يتقن هذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة تطوير المحورية، والتماثل كسر وخلية القرار الأحداث. وبشكل أكثر تحديدا، هذه المجاميع لديها القدرة على توليد برك من الخلايا التي كانت حتى الآن غير متوفرة في الثقافة، مثل النخاع الشوكي والدراجات الناريةالخلايا العصبية ص.
الأخلاقية ملاحظة: تجدر الإشارة مع الحذر الواجب أن ترجمة هذا البروتوكول لES الإنسان أو زراعة الخلايا المحفزة يمكن أن تجلب المجرب على مقربة من الأساس القانوني للحدود أربعة عشر يوما على أبحاث الأجنة البشرية، وهي الجيل من خط بدائي، كما هو مفصل في قانون الإنسان التخصيب وعلم الأجنة 2008 (UK) 42. منذ صدور قانون يغطي جميع الأجنة البشرية الحية بغض النظر عن طريقتها في الخلق، من شأنه أن ثقافة gastruloids الإنسان ما وراء خط-بدائية مثل المرحلة سيكون خارج نطاق الأبحاث للترخيص.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويتم تمويل هذا العمل من قبل جائزة الباحث ERC المتقدم لAMA (DAT، TB) مع مساهمة من منحة المشروع من ويلكوم ترست لAMA، وهو studentship EPSRC لPB-J وإيراسموس، مؤسسة Stichting د. هندريك مولر Vaderlandsch فون وFundatie فان دي Vrijvrouwe فان Renswoude الشركة المصرية للاتصالات 'S-GRAVENHAGE إلى SCvdB. نريد ان نشكر J. بريسكو، S. مونيوز Descalzo، C. شروتر، وT. رودريجيز، لإجراء مناقشات وانتقادات بناءة، خواكين دي Navascués لبروتوكول المتوسط تصاعد وكلا AK Hadjantonakis وC. Budjan لتبادل البروتوكولات المخبرية الخاصة بهم المتعلقة تلطيخ الأجنة كلها جبل. إصدار سابق من هذه المادة وقدم متاحة في السابق على bioRxiv ورقة خادم 29.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Gibco/Invitrogen | 31350-010 | |
| 25cm2 Cell Culture Flask | Grenier Bio-one | 690 175 | |
| Benchtop Centrifuge | MSE | MSB020.CX1.5 | |
| BES Buffered Saline (BBS) | Sigma-Aldrich | B2891 | BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl |
| Centrifuge tubes (15 or 50ml) | Greiner Bio-One | 118271 or 227261 | |
| CHIR 99021 (Chi) | CSCR | n/a | Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10mM in DMSO |
| Dissection Well (30mm Internal Diameter) | Fisher Scientific | 12678586 | |
| ESLIF | 500 mL GMEM, 5mL Sodium Pyruvate, 5 mL Non-Essential Amino Acids, 5 mL Glutamax, 1 mL beta-mercaptoethanol, 50 mL FBS and 550 µL LIF (1000 units). | ||
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use. |
| Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Improved Neubauer Haemocytometer | Hawksley | AS1000 | |
| Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant | CSCR | n/a | Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. |
| n-Propyl-gallate | Sigma-Aldrich | 02370 | |
| N2B27/NDiff 227 | Stemcells, Inc. | SCS-SF-NB-02 | http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco/Invitrogen | 11140-035 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | With Calcium and Magnesium |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-039 | |
| Sterile Reservoir | STARLAB | E2310-1010 | |
| Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate | Grenier Bio-one | 650185 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
References
- Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl Acad. Sci. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488-488.e2 (2011).
- Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annu Rev. Cell Dev. Biol. 28, 687-717 (2012).
- Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).
- Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies. Dev. Biol. 371 (2), 170-179 (2012).
- ten Berge, D., Koole, W., Fuerer, C., Fish, M., Eroglu, E., Nusse, R. Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies. Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).
- Nostro, M. C., Cheng, X., Keller, G. M., Gadue, P. Wnt, Activin, and BMP Signaling Regulate Distinct Stages in the Developmental Pathway from Embryonic Stem Cells to Blood. Cell Stem Cell. 2 (1), 60-71 (2008).
- Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate. Cell. 160, 1-16 (2015).
- Leahy, A., Xiong, J. W., Kuhnert, F., Stuhlmann, H. Use of developmental marker genes to define temporal and spatial patterns of differentiation during embryoid body formation. J. Exp. Zool. 284 (1), 67-81 (1999).
- Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Koehler, K. R., Hashino, E. 3D mouse embryonic stem cell culture for generating inner ear organoids. Nat. Protoc. 9 (6), 1229-1244 (2014).
- Lancaster, M. A., Renner, M., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Marikawa, Y., Tamashiro, D. A. A., Fujita, T. C., Alarcon, V. B. Aggregated P19 mouse embryonal carcinoma cells as a simple in vitro model to study the molecular regulations of mesoderm formation and axial elongation morphogenesis. Genesis. 47 (2), 93-106 (2000).
- Keller, R., Danilchik, M. Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis. Development. 103 (1), 193-209 (1988).
- Ishihara, K., Tonegawa, Y., Suyemitsu, T., Kubo, H. The blastocoelic fluid of sea urchin embryo induces exogastrulation. J. Exp. Zool. 220 (2), 227-233 (1982).
- Horstadius, S. The Mechanisms of Sea Urchin Development, Studied by Operative Methods. Bio. Rev. 14 (2), 132-179 (1939).
- Holtfreter, J. Die totale Exogastrulation, eine Selbstablösung des Ektoderms vom Entomesoderm. Wilhelm Roux’Archiv für Entwicklungsmechanik der Organismen. 129 (4), 669-793 (1933).
- van den Brink, S. C., Baillie-Johnson, P., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organization in aggregates of mouse ES cells. Development. 141 (22), (2014).
- Eiraku, M., Watanabe, K., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Turner, D. A., Hayward, P., et al. Wnt/β-catenin and FGF signaling direct the specification and elongation of a neural axial progenitor in ensembles of mouse ES cells. Development. 141 (22), (2014).
- Faunes, F., Hayward, P., et al. A membrane-associated β-catenin/Oct4 complex correlates with ground-state pluripotency in mouse embryonic stem cells. Development. 140 (6), 1171-1183 (2013).
- Kalmar, T., Lim, C., et al. Regulated Fluctuations in Nanog Expression Mediate Cell Fate Decisions in Embryonic Stem Cells. PLoS Biol. 7 (7), e1000149 (2009).
- Turner, D. A., Trott, J., Hayward, P., Rué, P., Martinez Arias, ., A, An interplay between extracellular signalling and the dynamics of the exit from pluripotency drives cell fate decisions in mouse ES cells. Biol. Open. 3 (7), 614-626 (2014).
- Turner, D. A., Rué, P., Mackenzie, J. P., Davies, E., Martinez Arias, ., A, Brachyury cooperates with Wnt/β-Catenin signalling to elicit Primitive Streak like behaviour in differentiating mouse ES cells. BMC Biol. 12 (1), 63 (2014).
- Ying, Q. -. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Ying, Q. -. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat. Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).
- Rivera-Perez, J. A., Hadjantonakis, A. -. K., Johnson, R., Sun, X., Escalante-Alcalde, D. . Molecular Embryology of the Mouse. , 1-90 (2011).
- Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, ., A, Generation of Aggregates of Mouse ES Cells that Show Symmetry Breaking, Polarisation and Emergent Collective Behaviour in vitro. bioRxiv. , (2014).
- Fehling, H. J., Lacaud, G., et al. Tracking mesoderm induction and its specification to the hemangioblast during embryonic stem cell differentiation. Development. 130 (17), 4217-4227 (2003).
- Ring, D. B., Johnson, K. W., et al. Selective Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors Potentiate Insulin Activation of Glucose Transport and Utilization In Vitro and In Vivo. Diabetes. 52 (3), 588-595 (2003).
- Inman, G. J., Nicolás, F. J., et al. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol Pharmacol. 62 (1), 65-74 (2002).
- Hao, J., Daleo, M. A., et al. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PLoS ONE. 3 (8), e2904 (2008).
- Neely, M. D., Litt, M. J., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chem. Neurosci. 3 (6), 482-491 (2012).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Niakan, K. K., Ji, H., Eggan, K. 12 Sox17 promotes differentiation in mouse embryonic stem cells by directly regulating extraembryonic gene expression and indirectly antagonizing self-renewal. Genes Dev. 24 (3), 312-326 (2010).
- Chambers, I., Silva, J., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).
- Rhee, J. M., Pirity, M. K., et al. et al. In vivo imaging and differential localization of lipid-modified GFP-variant fusions in embryonic stem cells and mice. Genesis. 44 (4), 202-218 (2006).
- Serup, P., Gustavsen, C., et al. Partial promoter substitutions generating transcriptional sentinels of diverse signaling pathways in embryonic stem cells and mice. Dis. Models Mech. 5 (6), 956-966 (2012).
- Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Chemical Biology. 11 (8), 847-854 (2014).
- . . Human Fertilisation and Embryology ACT 2008 – Elizabeth II. , (2008).
