Summary

Bir Klinik İlgili kurulması<em> Ex Vivo</emYerli mikroçevresinin Epitelyal Yara Tamir incelenmesi için> Mock Katarakt Cerrahisi Modeli

Published: June 05, 2015
doi:

Summary

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Abstract

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Introduction

klinik olarak anlamlı, sahte katarakt cerrahisi, burada açıklanan ex vivo epitel yara iyileşmesi modeli bir yaralanma tepki olarak epitel dokuların onarımını düzenleyen mekanizmaları araştırmak için bir araç sağlamak için geliştirilmiştir. Bu modeli oluştururken için amaçlanmıştır Temel özellikler, yakından onarma işlemini bir kültür ayarı, 2), tamir düzenleyici unsurları modüle kolaylığı yaralama in vivo cevabı çoğaltılmış ve görüntü 3) yeteneği 1) sağlayan koşullar dahil gerçek zamanlı olarak bütünüyle içinde. meydan, bu nedenle, hücrelerin doğal mikroçevresinin, epitel yara onarımı incelemek mümkün olduğu bir kültür modeli oluşturmak ve işlemek için oldu. Bu yara onarım modelinin mevcudiyeti onarım sürecini düzenleyen matriks proteinleri, sitokinler ve kemokinlerin endojen sinyal ipuçları belirlenmesi için yeni olanaklar açar. Buna ek olarak, bir model incelenmesi için idealdir nasıln epitel yara alan 2,3, reepitelizasyonu için kolektif bir levha olarak ve yaralı epiteli 4 kolektif göç yönetmenlik işlev yara kenarında mezenkimal lideri hücrelerinin soy belirlemek için hareket edebilmektedir. Bu model de etkili yara iyileşmesini teşvik etmek ve anormal yara onarım 5 engelleyebilir terapötikleri belirlemek için bir platform sağlar.

Mevcut yara tamir modelleri bir dizi kültürü ve günümüzde yara onarım süreci hakkında bilinenlerin çoğu sağladı vivo, hem de zaten vardır. Böyle kornea 6-12 ve cilt 13-17 gibi hayvan modellerinde yaralanma, olarak, katkıları da dahil olmak üzere süreçte yer olabilir tüm tamir arabulucuların bağlamında yaralama doku yanıtını incelemek için fırsat var damarlar ve sinir sistemi. Ancak, bu deneyimlerden manipüle sınırlamalar vardırin vivo olarak zihinsel koşullar ve zaman içinde sürekli olarak, in vivo olarak onarım yanıtı görüntüleme çalışmaları yürütmek üzere henüz mümkün değildir. Bunun aksine, örneğin çizilmeye yara çok in vitro yara onarımı kültürü modelleri, kolayca manipüle edilebilir ve zaman içinde takip ancak in vivo dokusunda yara iyileşmesinin okuyan çevresel bağlamı yoksundur. Ex vivo modeller sürecinde herhangi bir zaman noktasında onarım moleküler regülatörleri modüle yeteneği ile birleştiğinde hücrelerin mikroçevresinin bağlamında zamanla sürekli yaralanma onarım işlemini okuyan avantajı sunarken, bu uygun birkaç model var parametreleri.

İşte fizyolojik yaralama bir epitel dokusunun yanıtını yeniden kültürleri şifa yüksek tekrarlanabilir ex vivo epitel yara oluşturmak için bir prosedür açıklanmaktadır. Bir doku kaynağı, bir ex vivo moc olarak civciv embriyo lens kullanarakk katarakt cerrahisi yapılmaktadır. Lens avasküler, innerve ve eşlik eden stroma 18,19 serbest değil, o kendi kendine yeten bir kalın bazal membran kapsül içinde olduğundan bu çalışmalar için kullanılacak ideal bir dokudur. İnsan hastalıkta, katarakt cerrahisi nedeniyle lensin opasifikasyon için görme kaybı giderir ve lens toplu içermektedir lens fiber hücre kitlesinin, kaldırılmasını içerir. Aşağıdaki katarakt cerrahisi görme yapay göz içi lensi yerleştirilmesi yoluyla geri yüklenir. katarakt ameliyatı prosedürü, lif hücrelerinin çıkarılması, Fiber hücreleri tarafından işgal edilmiş olan mercek kapsülünün arka bölgenin yeniden epitelizasyon ile yanıt verir bitişik lens epitelyum, bir yaralanma tepkisini indükler. Katarakt cerrahisi, çoğu yara tamir yanıtları gibi, bazen lens Arka Capsu olarak bilinen miyofibroblastlar ortaya çıkması ile ilişkili yara iyileşmesi yanıt bir anormal fibrotik sonucunu ortaya çıkmaktadırle Opasitesi 20-22. Katarakt ameliyatı yara iyileşmesi modeli oluşturmak için, katarakt cerrahisi prosedürü fizyolojik bir yaralanma üretmek için civciv embriyo göz kaldırılır lenslerde taklit edilir. Mercek epitelyal hücreleri tarafından çevrelenmiş bir çok tutarlı dairesel bir yara bölgesinde lens elyaf hücrelerinin sonuçları Mikrocerrahi çıkarılması. Bu hücre popülasyonu sıkıca mercek bazal membran kapsüle bağlı kalır ve cerrahi prosedür ile yaralandı. epitel hücreleri lider hücreleri 1 olarak onarım sürecinde bilinen vimentin zengin mezenkimal hücre popülasyonu tarafından yönetilen yara, iyileşmek için endojen bazal membran arındırılır alan üzerine göç ederler. Bu model ile yaralanma bir epitel yanıtı kolaylıkla görülebilir ve hücrelerin mikroçevresinin bağlamında zamanla izledi. Hücreler ifadesi ya da yara iyileşmesi bir rol oynaması beklenmektedir moleküllerin aktivasyonu modifikasyonlara kolaylıkla temin edilebilir. Th bir güçlü özelliğiModel izole etmek ve yara iyileşmesi çerçevesinde göç özgü değişiklikleri incelemek için yeteneğidir olduğunu. çalışmalar için yaş uyumlu ex vivo olarak yara iyileşme kültürler çok sayıda hazırlanması için yeteneği, bu modelin bir diğer avantajdır. Böylece, bu model sistemi yara iyileşme süreci üzerindeki etkisi yara onarım mekanizmalarını ve test terapötik ayrı kızdırmak için eşsiz bir fırsat sunuyor. ex vivo sahte katarakt cerrahisi modeli yaralanma tamir mekanizmaları çalışmak için kritik bir kaynak sağlayarak, geniş uygulama olması bekleniyor.

Protocol

Aşağıdaki protokol Thomas Jefferson Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallarına ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım ARVO Bildirimi ile uyumludur. Ex Vivo Yara Kültür Lensler 1. Kurulum ve Hazırlık Steril, laminer akış başlığı içinde üç adet 100 mm petri kapları yerleştirin. Oda sıcaklığında, yarım Tris / Dekstroz tamponu ile petri kutularının iki (140 mM NaCI, 5 mM KCI, 0.7 mM Na-2 PO 4, 5 m…

Representative Results

Ex Vivo Model hücrelerin doğal mikroçevresinin yara iyileşme sürecini incelemek için oluşturulan Hücrelerin doğal mikroçevresinin içinde epitel yara iyileşmesini düzenleyen katılan mekanizmalarını araştırmak için, klinik olarak anlamlı ex vivo sahte katarakt cerrahisi modeli oluşturuldu. Bu model nedeniyle yapısal özellikleri konusunda pek çok avantajlar sunmaktadır mercek dokularından oluşturulur: 1) objektif mercek kapsülü olarak adlandırıla…

Discussion

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryoni…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health Grant to A.S.M. (EY021784).

Materials

Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-3 Use at 140mM in TD Buffer
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific P217-500 Use at 5mM in TD Buffer
Sodium Phosphate (Na2HPO4) Sigma S0876 Use at .7mM in TD Buffer
D-glucose (Dextrose) Fisher Scientific D16-500 Use at 0.5mM in TD Buffer
Tris Base Fisher Scientific BP152-1 Use at 8.25mM in TD Buffer
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144-500 Use to pH TD buffer to 7.4
Media 199 GIBCO 11150-059
L-glutamine Corning/CellGro 25-005-CI Use at 1% in Media199
Penicillin/streptomycin Corning/CellGro 30-002-CI Use at 1% in Media199
100mm petri dishes Fisher Scientific FB0875711Z
Stericup Filter Unit Millipore SCGPU01RE Use to filter sterilize Media
Dumont #5 forceps (need 2) Fine Science Tools 11251-20
35mm Cell Culture Dish Corning 430165
27 Gauge 1mL SlipTip with precision glide needle BD 309623
Fine Scissors Fine Science Tools 14058-11
Standard Forceps Fine Science Tools 91100-12
Other Items Needed: General dissection instruments,  fertile white leghorn chicken eggs, 
check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting 
microscope

References

  1. Walker, J. L., et al. Unique precursors for the mesenchymal cells involved in injury response and fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 13730-13735 (2010).
  2. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10, 445-457 (2009).
  3. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of laboratory automation. 17, 59-65 (2012).
  4. Khalil, A. A., Friedl, P. Determinants of leader cells in collective cell migration. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 2, 568-574 (2010).
  5. Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative ophthalmology & visual science. 48, 2214-2223 (2007).
  6. Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 1045-1053 (2000).
  7. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative ophthalmology & visual science. 45, 1775-1788 (2004).
  8. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental eye research. 93, 927-936 (2011).
  9. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental eye research. 121, 178-193 (2014).
  10. Kuwabara, T., Perkins, D. G., Cogan, D. G. Sliding of the epithelium in experimental corneal wounds. Investigative ophthalmology. 15, 4-14 (1976).
  11. Sherrard, E. S. The corneal endothelium in vivo: its response to mild trauma. Experimental eye research. 22, 347-357 (1976).
  12. Stramer, B. M., Zieske, J. D., Jung, J. C., Austin, J. S., Fini, M. E. Molecular mechanisms controlling the fibrotic repair phenotype in cornea: implications for surgical outcomes. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4237-4246 (2003).
  13. Escamez, M. J., et al. An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice. The Journal of investigative dermatology. 123, 1182-1191 (2004).
  14. Werner, S., Breeden, M., Hubner, G., Greenhalgh, D. G., Longaker, M. T. Induction of keratinocyte growth factor expression is reduced and delayed during wound healing in the genetically diabetic mouse. The Journal of investigative dermatology. 103, 469-473 (1994).
  15. Tarin, D., Croft, C. B. Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin. II. Dermo-epidermal interrelationships. Journal of anatomy. 106, 79-91 (1970).
  16. Croft, C. B., Tarin, D. Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin I. Epithelial behaviour. Journal of anatomy. 106, 63-77 (1970).
  17. Winstanley, E. W. The epithelial reaction in the healing of excised cutaneous wounds in the dog. Journal of comparative pathology. 85, 61-75 (1975).
  18. Wormstone, I. M., Wride, M. A. The ocular lens: a classic model for development, physiology and disease. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 366, 1190-1192 (2011).
  19. Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Experimental eye research. 88, 151-164 (2009).
  20. Awasthi, N., Guo, S., Wagner, B. J. Posterior capsular opacification: a problem reduced but not yet eradicated. Archives of ophthalmology. 127, 555-562 (2009).
  21. Walker, T. D. Pharmacological attempts to reduce posterior capsule opacification after cataract surgery–a review. Clinical & experimental ophthalmology. 36, 883-890 (2008).
  22. Schmidbauer, J. M., et al. Posterior capsule opacification. International ophthalmology clinics. 41, 109-131 (2001).
  23. Menko, A. S., et al. A central role for vimentin in regulating repair function during healing of the lens epithelium. Molecular biology of the cell. 25, 776-790 (2014).
  24. Chauss, D., et al. Differentiation state-specific mitochondrial dynamic regulatory networks are revealed by global transcriptional analysis of the developing chicken lens. G3 (Bethesda). 4, 1515-1527 (2014).
  25. Leonard, M., Zhang, L., Bleaken, B. M., Menko, A. S. Distinct roles for N-Cadherin linked c-Src and fyn kinases in lens development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 242, 469-484 (2013).
  26. Sieg, D. J., et al. FAK integrates growth-factor and integrin signals to promote cell migration. Nature cell biology. 2, 249-256 (2000).
  27. Sieg, D. J., Hauck, C. R., Schlaepfer, D. D. Required role of focal adhesion kinase (FAK) for integrin-stimulated cell migration. Journal of cell science. 112 (Pt 16), 2677-2691 (1999).
  28. Hauck, C. R., Hsia, D. A., Schlaepfer, D. D. The focal adhesion kinase–a regulator of cell migration and invasion). IUBMB life. 53, 115-119 (2002).
  29. Zhao, X., Guan, J. L. Focal adhesion kinase and its signaling pathways in cell migration and angiogenesis. Advanced drug delivery reviews. 63, 610-615 (2011).
  30. Menko, A. S., Bleaken, B. M., Walker, J. L. Regional-specific alterations in cell-cell junctions, cytoskeletal networks and myosin-mediated mechanical cues coordinate collectivity of movement of epithelial cells in response to injury. Experimental cell research. 322, 133-148 (2014).
  31. Martin, P. Wound healing–aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
  32. Ferguson, M. W., O’Kane, S. Scar-free healing: from embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 839-850 (2004).
  33. Redd, M. J., Cooper, L., Wood, W., Stramer, B., Martin, P. Wound healing and inflammation: embryos reveal the way to perfect repair. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 777-784 (2004).
  34. Nodder, S., Martin, P. Wound healing in embryos: a review. Anatomy and embryology. 195, 215-228 (1997).
  35. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).

Play Video

Citer Cet Article
Walker, J. L., Bleaken, B. M., Wolff, I. M., Menko, A. S. Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment. J. Vis. Exp. (100), e52886, doi:10.3791/52886 (2015).

View Video