Upptäckt av Axonally Lokaliserad mRNA i hjärnan sektioner Använda hög upplösning<em> In Situ</em> Hybridisering

Axonal mRNA rekrytering och lokal översättning möjliggöra axoner att svara på extracellulära stimuli i en tidsmässigt och geografiskt akut sätt ^1. Intra-axonal proteinsyntes förstås bäst i samband med nervsystemets utveckling där det spelar avgörande roller i tillväxten konen beteende ^2-8, axon pathfinding ^9-11 och bakåtsträvande signalering ^12,13. Men mycket mindre är känt om den funktionella betydelsen av axonal proteinsyntes i post-utvecklings nervceller när axonal mRNA och ribosomen nivåer kraftigt reducerad ^14,15. Mogna ryggradsdjur axoner har länge ansetts vara translationellt inaktiva ^16. Men nya studier tyder på att lokal översättning återaktiveras i mogna axoner i patologiska tillstånd. Till exempel är en delmängd av mRNA rekryteras till regenererande axoner följande krävs nervskador och inom axonal proteinsyntes för korrekt regenerering av dessa axoner ^17. Dessutom vår grupp haar visat att specifika mRNA rekryteras till axoner efter lokal exponering för Alzheimers sjukdom peptid Ap _1-42, och lokal översättning av transkriptionsfaktorn ATF4 krävs för att fortplanta de neurodegenerativa effekter av Ap _1-42 från axoner till den neuronala soma ^18. Slutligen har hög genomströmning analyser visade att mogna axoner har en mer komplex och dynamisk transkriptom än väntat ^18-21, speciellt under patologiska tillstånd. I ljuset av dessa studier, att en mycket känslig och specifik metod detektera axonally lokaliserade mRNA i den vuxna nervsystemet behövs.

En stor del av arbetet med mRNA rekrytering och lokal översättning i mogna axoner har utförts på odlade nervceller. Detta gäller särskilt för transkriptom analyser eftersom specialiserade odlingsmetoder finns som tillåter isolering av axoner från somato-dendritiska fack ^18-20. Även om sådana studier har gett värdefulla insight in i rollen som lokal översättning i mogna axoner, frågan huruvida odlade nervceller troget representerar situationen in vivo eller om mRNA rekrytering är en adaptiv respons av axoner till odlingsbetingelser är fortfarande öppen. Få studier har gett bevis på mRNA rekrytering till mogna axoner in vivo. Till exempel har avskriften kodar för luktmarkörproteinet påvisats i axoner hos vuxna sensoriska neuroner ^22. En transgen innehållande 3 'UTR av β-aktin mRNA transporteras till axoner i perifera och centrala nervsystemet nervceller hos möss och lokalt översatt efter utvecklingsperioder ^23. Lamin b2 mRNA lokaliserad till retinala axoner i Xenopues laevis grodyngel och dess utarmning påverkar Axon underhåll efter axonal utveckling ^21. Störningar med axonal transport av mRNA som kodar för cytokrom c oxidas IV förändrar mus beteende ^24. Slutligen Atf4 mRNA hittas i vuxen enXons av möss och mänskliga hjärnor inom ramen för A-beta _1-42 inducerad neurodegeneration ^18.

Hög genomströmning transkriptom analyser har visat sig vara användbara för att identifiera mRNA profiler i isolerade axoner in vitro men har begränsningar för in vivo-studier eftersom hela vävnader axoner är aldrig hittat isolerat utan blandas med neuronala cellkroppar, gliaceller och andra celltyper. Således sådana analyser måste kombineras med avbildningstekniker som bekräftar subcellulära lokalisering av mRNA. RNA in situ-hybridisering (RNA ISH) medger detektering och visualisering av specifika RNA-sekvenser i celler och vävnader. Men ursprungliga RNA ISH-analyser var lämplig endast för identifiering av mycket rikliga RNA ^25, vilket sällan är fallet för axonally lokaliserade mRNA. Under de senaste årtiondena ökade ansträngningar har lagts på att utveckla ny teknik som möjliggör detektion av mRNA vid enda molekyl nivå <sup> 25,26. Till exempel har Singer och kollegor utvecklat ISH prober för att detektera mRNA i enskilda celler, som består i 5 icke överlappande fluorescerande 50-merer (för mer information se ^27). Den största skillnaden mellan de ovan nämnda tekniker och en här beskrivna är att de senare använder 20 dubbel Z-struktur (inte linjär) sonder som vanligtvis riktar ~ 1 kb region av RNA av intresse att säkerställa specificitet och låga bakgrundshalter. Prober hybridiseras sedan med förförstärkare och förstärkare sekvenser som slutligen fluorescerande eller konjugerade med enzymer som gör kromogena reaktioner. Dessa förstärkningssteg förbättra signal-till-brusförhållande jämfört med andra ISH teknik ^28. Här beskriver vi två protokoll som använder RNAscope kombinerat antingen med fluorescens immunocytokemi eller med histologiska färgämnen möjliggör axonal motfärgning. Båda protokollen är lämpliga för att visualisera axonal lokalisering av Atf4 mRNA i vuxen moanvända och mänskliga hjärnor.