Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução<em> In Situ</em> Hibridização

Recrutamento mRNA axonal e tradução local permitir axônios de responder a estímulos extracelulares de uma forma temporal e espacialmente aguda ^1. Síntese da proteína intra-axonal é melhor compreendida no contexto de neurodesenvolvimento, onde ele desempenha um papel crucial no crescimento do cone de comportamento ^{2-8, 9-11} pathfinding axonal retrógrado e sinalização ^12,13. Mas muito menos se sabe sobre o significado funcional da síntese de proteínas axonal em neurónios pós-desenvolvimento, quando os níveis de mRNA e ribossomas axonal são muito reduzidas ^14,15. Axônios vertebrados maduros têm sido pensado para ser traducionalmente inativo ^16. No entanto, estudos recentes indicam que a tradução local é reativado em axônios maduras em condições patológicas. Por exemplo, um subconjunto de mRNAs é recrutado para axónios em regeneração após a lesão do nervo e a síntese de proteínas intra-axonal é necessária para a regeneração de axónios correcta destes ^17. Além disso, o nosso grupo has demonstrou que mRNAs específicos são recrutados para os axônios após exposição local à doença de Alzheimer peptídeo Aâ _1-42, e tradução local do ATF4 fator de transcrição é necessária para propagar os efeitos neurodegenerativos de Ap _1-42 de axônios para a soma neuronal ^18. Finalmente, análises de alto rendimento têm revelado que os axônios maduros têm um transcriptoma mais complexo e dinâmico do que o esperado ^18-21, especialmente sob condições patológicas. À luz destes estudos, um método altamente sensível e específico para a detecção de mRNAs axonally localizados no sistema nervoso adulto é necessária.

Grande parte do trabalho sobre recrutamento mRNA e tradução local em axônios maduras foi realizada em neurônios cultivados. Isto é especialmente verdadeiro para as análises do transcriptoma de cultura uma vez que não existem métodos especializados que permitem o isolamento de axónios do compartimento da somato-dendrítico ^18-20. Embora esses estudos tenham dado ins valiososight para o papel da tradução local em axônios maduros, a questão de saber se neurônios cultivados representam fielmente a situação in vivo ou se o recrutamento mRNA é uma resposta adaptativa dos axônios para condições de cultura ainda está aberta. Poucos estudos têm fornecido evidências de recrutamento mRNA para amadurecer axônios in vivo. Por exemplo, o transcrito que codifica para a proteína marcadora olfactiva tem sido detectada em axónios em neurónios sensoriais adultos ^22. Um transgene contendo 3 'UTR do mRNA β-actina é transportado para axónios em neurónios do sistema nervoso periférico e central, nos ratinhos, e é localmente traduzido após períodos de desenvolvimento ^23. Lamin b2 mRNA é localizada axônios da retina em Xenopues laevis girinos e seu esgotamento afeta manutenção axônio após o desenvolvimento axonal ^21. Interferência com o transporte axonal do ARNm que codifica para o citocromo C oxidase IV altera o comportamento do rato ^24. Finalmente, ATF4 ARNm é encontrado em um adultoXONs de ratos e cérebros humanos no contexto de Ap _1-42 induzida neurodegeneração ^18.

Transcriptoma análises de alto rendimento têm provado ser útil para identificar perfis de mRNA em axônios isolado in vitro, mas tem limitações para estudos in vivo uma vez que em tecidos completos axônios nunca são encontrados isoladamente, mas misturado com corpos celulares neuronais, células gliais e outros tipos de células. Assim, essas análises têm de ser combinadas com as técnicas de imagem que confirmem a localização subcelular de mRNAs. RNA de hibridação in situ (ISH ARN) permite a detecção e a visualização de sequências de RNA específicas em células e tecidos. No entanto, os ensaios de ARN ISH originais foram adequado apenas para a identificação de ARN altamente abundantes ^25, que é raramente o caso para o ARNm axonally localizadas. Para as últimas décadas crescentes esforços têm sido postas em desenvolvimento novas tecnologias que permitem a detecção de ARNm no nível de uma única molécula <sup> 25,26. Por exemplo, Singer e seus colegas desenvolveram sondas ISH para detectar mRNAs em células individuais, que consiste em 5 não sobrepostas marcado por fluorescência 50-meros (para obter detalhes consulte o ^27). A principal diferença entre as técnicas acima mencionadas e aquela aqui descrito é que a posterior usa 20 Z-estrutura dupla (não linear), que tipicamente têm como alvo sondas ~ 1 kb da região de ARN de interesse assegurar a especificidade e baixos níveis de fundo. As sondas são então hibridados com sequências pré-amplificador e do amplificador que estão, finalmente, marcados com fluorescência ou conjugados com enzimas que permitem reacções cromogénicos. Estes passos de amplificação melhorar a relação sinal-para-ruído em comparação com outras tecnologias de ISH ^28. Aqui nós descrevemos dois protocolos utilizando RNAscope combinada ou com fluorescência imunocitoquímica ou com corantes histológicos permitindo counterstaining axonal. Ambos os protocolos são adequados para visualizar localização axonal de ATF4 mRNA em mo adultoe utilizar os cérebros humanos.