الكشف عن Axonally المترجمة من mRNAs في أقسام المخ باستخدام عالية الدقة<em> في الموقع</em> التهجين
Summary
RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.
Abstract
في كثير من الأحيان يتم ترجمة من mRNAs إلى محاور الفقارية ومطلوب ترجمة المحلية لالاستطلاعية محور عصبي أو المتفرعة خلال تطوير وصيانة وإصلاح أو التنكس العصبي في فترات تال للنماء. وقد كشفت التحاليل إنتاجية عالية مؤخرا أن محاور لها Transcriptome على أكثر ديناميكية وتعقيدا مما كان متوقعا في السابق. هذه التحليلات، ومع ذلك تم القيام به في الغالب في الخلايا العصبية مثقف حيث المحاور يمكن عزلها من مقصورات somato شجيري. يكاد يكون من المستحيل لتحقيق مثل هذه العزلة في الأنسجة كلها في الجسم الحي. وبالتالي، من أجل التحقق من تجنيد من mRNAs وأهميتها الوظيفية في الحيوان كله، ينبغي من الناحية المثالية يمكن الجمع بين التحليلات Transcriptome على مع التقنيات التي تسمح تصور من mRNAs في الموقع. مؤخرا، تم تطوير تكنولوجيات جديدة ISH التي تكشف عن الرنا على مستوى واحد جزيء. هذا مهم بشكل خاص عند تحليل توطين التحت خلوية من مرنا، وعادة ما وجدت الرنا المترجمة منذ عند مستويات منخفضة. نحن هنا وصف بروتوكولين للكشف عن من mRNAs المترجمة axonally-باستخدام تكنولوجيا فائقة الحساسية RNA ISH الرواية. جمعنا بين RNAscope ISH مع مباين المحاور باستخدام المناعية مضان أو الأصباغ النسيجية للتحقق من تجنيد Atf4 مرنا إلى المحاور في الجسم الحي في الماوس ناضجة والعقول البشرية.
Introduction
التوظيف مرنا محور عصبي والترجمة المحلية تمكن المحاور كي تستجيب للمثيرات خارج الخلية بطريقة زمنيا ومكانيا الحادة 1. وأفضل طريقة لفهم تخليق البروتين داخل محور عصبي في سياق النمو العصبي حيث أنه يلعب دورا حاسما في نمو السلوك مخروط 08/02، 11/09 ومحور عصبي الاستطلاعية إلى الوراء مما يشير إلى 12،13. ولكن أقل بكثير من المعروف عن أهمية وظيفية من تخليق البروتين في الخلايا العصبية محور عصبي بعد التنموية عندما يتم تخفيض مستويات مرنا والريبوسوم محور عصبي إلى حد كبير 14،15. منذ فترة طويلة كان يعتقد المحاور الفقارية ناضجة لتكون خاملة translationally 16. ومع ذلك، تشير الدراسات الحديثة إلى أن الترجمة المحلية وإعادة تنشيطها في محاور عصبية ناضجة في ظل ظروف مرضية. على سبيل المثال، تم تجنيد مجموعة فرعية من المحاور من mRNAs لتجديد التالية مطلوبة إصابة العصب وتخليق البروتين داخل محور عصبي لتجديد الصحيح لهذه المحاور 17. بالإضافة إلى ذلك، لدينا مجموعة هكتارأظهرت الصورة التي يتم تجنيدهم من mRNAs محددة لمحاور عصبية بعد مطلوب التعرض المحلي لمرض الزهايمر الببتيد Aβ 1-42، والترجمة المحلية للعامل النسخ ATF4 لنشر آثار العصبية من Aβ 1-42 من العصبونات إلى سوما الخلايا العصبية (18). أخيرا، كشفت التحليلات الإنتاجية العالية التي محاور عصبية ناضجة لديها Transcriptome على أكثر تعقيدا وديناميكية من المتوقع 18-21، خاصة في ظل الظروف المرضية. في ضوء هذه الدراسات، وهي طريقة حساسة للغاية ومحددة للكشف عن الحاجة من mRNAs محلية axonally في الجهاز العصبي الكبار.
وقد تم تنفيذ الكثير من العمل على تجنيد مرنا والترجمة المحلية في محاور عصبية ناضجة على الخلايا العصبية مثقف. هذا ينطبق بشكل خاص لTranscriptome على تحليلات منذ أساليب زراعة المتخصصة موجودة التي تسمح للعزلة محاور من-somato شجيري مقصورة 18-20. على الرغم من أن أعطت هذه الدراسات الإضافية القيمةآيت إلى دور الترجمة المحلية في محاور عصبية ناضجة، مسألة ما إذا كانت الخلايا العصبية مثقف تمثل بصدق الوضع في الجسم الحي أو إذا التوظيف مرنا هو استجابة تكيفية من المحاور لظروف زراعة لا يزال مفتوحا. وقد وفرت دراسات قليلة أدلة على تجنيد مرنا حتى تنضج المحاور في الجسم الحي. على سبيل المثال، تم الكشف عن نص الترميز للبروتين علامة حاسة الشم في محاور الخلايا العصبية الحسية في البالغين 22. ويتم نقل A التحوير الذي يحتوي على 'UTR 3 من-β أكتين مرنا لمحاور الخلايا العصبية في الجهاز العصبي الطرفية والمركزية في الفئران ويترجم محليا بعد فترات التنموية 23. المترجمة امين B2 مرنا إلى المحاور الشبكية في Xenopues المورق الضفادع الصغيرة ويؤثر نضوبها صيانة محور عصبي بعد تطوير محور عصبي 21. التدخل في نقل محور عصبي من الترميز مرنا لالسيتوكروم C أوكسيديز IV يغير سلوك الماوس 24. أخيرا، وجدت Atf4 مرنا في الكبار لxons من الفئران والعقول البشرية في سياق Aβ 1-42 يسببها التنكس العصبي 18.
وقد أثبتت التحليلات Transcriptome على الإنتاجية العالية ليكون من المفيد تحديد ملامح مرنا في المحاور معزولة في المختبر ولكن لديها قيود عليها في الدراسات المجراة منذ ذلك الحين في الأنسجة كلها تم العثور على محاور عصبية أبدا في عزلة بل تتداخل مع أجسام الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية وأنواع الخلايا الأخرى. وبالتالي، فإن هذه التحليلات يجب أن تكون جنبا إلى جنب مع تقنيات التصوير التي تؤكد توطين التحت خلوية من من mRNAs. RNA التهجين الموضعي (RNA ISH) في يتيح الكشف والتصور من تسلسل الحمض النووي الريبي محددة في الخلايا والأنسجة. ومع ذلك، كانت الأصلي فحوصات الحمض النووي الريبي ISH مناسبة فقط لتحديد الرنا وفيرة للغاية 25، وهو الحال بالنسبة ل mRNAs المترجمة axonally نادرا. على مدى العقود الماضية زيادة الجهود قد وضعت في تطوير تقنيات جديدة تسمح للكشف عن من mRNAs في مستوى واحد جزيء <suP> 25،26. على سبيل المثال، وضعت المغنية والزملاء تحقيقات ISH للكشف عن من mRNAs في زنازين انفرادية، ويتألف في 5 غير المتداخلة fluorescently المسمى 50 السائدة (لمزيد من التفاصيل تشير إلى 27). والفرق الرئيسي بين التقنيات المذكورة أعلاه، واحدة هنا وصفها هو أن يستخدم في وقت لاحق 20 مزدوج Z-هيكل (وليس الخطية) تحقيقات التي تستهدف عادة ~ 1 كيلوبايت المنطقة من الحمض النووي الريبي لضمان خصوصية الفائدة ومستويات خلفية منخفضة. ثم يتم تهجين تحقيقات مع المضخم ومكبر للصوت متواليات التي يتم أخيرا fluorescently المسمى أو مترافق مع الانزيمات التي تسمح ردود الفعل اللونية. هذه الخطوات التضخيم تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء بالمقارنة مع التكنولوجيات ISH أخرى 28. نحن هنا وصف بروتوكولين باستخدام RNAscope جنبا إلى جنب إما مع مضان مناعية أو مع الأصباغ النسيجية السماح counterstaining المحاور. كلا البروتوكولين هي مناسبة لتصور توطين محور عصبي من Atf4 مرنا في شهر الكباراستخدام والعقول البشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا التقرير وصفنا استخدام التكنولوجيا ISH عالية الدقة في الكشف عن مترجم axonally Atf4 مرنا. تظهر هذه والسابقة الدراسات المنشورة أن هذه التقنية متوافقة مع القائم على الأجسام المضادة الكشف عن البروتين في الأنسجة أو حتى الأجنة كلها 33. الأهم من ذلك أنها استخدمت مؤ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Alzheimer’s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer’s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions
Materials
| custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | In situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit – BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | In situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
References
- Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
- Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
- Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
- Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
- Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506 (2014).
- Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
- Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
- Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
- Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
- Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
- Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
- Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
- Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
- Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
- Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079 (2012).
- Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
- Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
- Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
- Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
- Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
- Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
- Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and Practice of Histotechnology. , (1987).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55 (2014).
- Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
