Lesiones Embarcaciones mecánica en embriones de pez cebra

NOTA: Procedimientos utilizando el pez cebra fueron aprobados por Institutional Animal Care de UCSF y el empleo.

1. Preparación de Herramientas

1. Inserte el pasador de minucias en un soporte de pasador y sujete el pasador.
2. Con unas pinzas de punta fina, doble cuidadosamente la punta del pasador para crear un ligero gancho.
3. Para la manipulación y la estabilización del embrión durante la lesión, doblar el extremo de un calibre 28 ½ pulgadas aguja montada en una jeringa de insulina con unos alicates de punta fina.

2. Preparación de embriones de pez cebra para Lesiones

1. Configure parejas reproductoras de pez cebra y recoger los huevos en el agua de huevo (sales acuario 60ug / mL) como se muestra previamente ^22.
2. Añadir 0,003% N-feniltiourea (PTU) al agua de huevo cuando los embriones son aproximadamente 8 horas después de la fecundación (HPF) para evitar melanization.
3. Dechorionate dos día después de la fertilización (dpf), los embriones antes del experimento utilizando unas pinzas de punta fina.
   
4. Anestesiar a los embriones con 0,02% tamponada de ácido 3-aminobenzoico (tricaína) aproximadamente 10 minutos antes de las manipulaciones.

3. Recipiente Mecánica Lesión de embriones

1. Transferencia de embriones anestesiados a una diapositiva depresión en un microscopio estereoscópico de disección utilizando una pipeta de transferencia.
2. Usando el lado plano corto de la aguja de la jeringa para manipular el embrión con la mano dominante, posicionar el embrión en su lado con la superficie ventral de espaldas a la aguja.
3. Coloque el pasador de minucias con la punta apuntando directamente contra la superficie ventral de la posterior peces a la abertura urogenital. Coloque el pasador de minucias en un ligero ángulo tal que la punta curvada es capaz de perforar a través de la peridermis directamente en la vena caudal (Figura 1 </ Strong>).
4. Uso de la aguja de la jeringa para manipular el embrión, perforar la vena caudal con el pasador de minucias tocando el embrión en el pasador para enganchar el pasador ligeramente en la vena.
5. Uso de la aguja de la jeringa, tire el embrión lejos de la clavija de minucias para crear un pequeño desgarro en el recipiente.
   NOTA: Una lesión éxito dará lugar a sangrado inmediato de la vena.

4. Análisis de la hemostasia

1. Elija sólo los embriones con visiblemente células sanguíneas circulantes para este procedimiento.
2. Preparar para iniciar el temporizador, tan pronto como el pasador de minucias se tira desde el recipiente.
3. Inicie el temporizador tan pronto como la pérdida de sangre puede ser visualizada de la herida. Cuando la pérdida de sangre de la herida cesa, detener el cronómetro y registrar el tiempo total como el tiempo de sangrado. Si se inhibe la coagulación, registrar el tiempo para cuando hay ya no visiblemente las células sanguíneas circulantes.

5. Análisis de Curación de Heridas

1. Pos de Transferenciaanimales camiseta de lesiones en placas de formación de imágenes de fondo de vidrio para microscopía.
2. Eliminar la mayor parte del agua del huevo.
3. Cubra los embriones en 0,3 a 1,2% de baja fusión de agarosa disueltos en el agua de huevo, se calentó a entre 42 y 45 ºC y suplementadas con 0.02% tricaína.
4. Posición embriones en sus lados con fórceps.
5. Después de la agarosa se enfría, llenar el plato con un 0,02% tricaína en agua huevo.
6. Adquirir imágenes con campo claro, epifluorescencia, o microscopía confocal.
7. Retire embrión de la agarosa utilizando pinzas y traslado de regreso al agua huevo.

Lesión de los vasos mecánica se realizó el 2 de fdd embriones (Figura 2A - C). Lesión resulta en una respuesta rápida y fiable de la coagulación como medidas por el tiempo hasta el cese de la hemorragia (Figura 2D). Para determinar si o no diferencias en la respuesta de coagulación se podrían medir, la hirudina anticoagulante se administró a los embriones mediante inyección en el conducto de Cuvier inmediatamente antes de heridas (5-10 nl de 1 unidad por l hirudina disuelto en agua) (para demostración de inyecciones en el conducto de Cuvier, ver artículo anterior JoVe ^{23) 24.} La administración de la hirudina antes de la lesión resultó en aumento de forma significativa los tiempos frente al control del vehículo (Figura 2D) sangrado.

Evidencia de daño de los vasos y la coagulación se puede observar inmediatamente después de la lesión usando líneas transgénicas para endotelial (kdrl: EGFP) y de glóbulos rojos (gata1a: DsRed 25,26. Las imágenes fueron adquiridas secuencialmente cada 5 min durante un período de 12 horas usando epifluorescencia. Representante imágenes fijas se muestran a lo largo de las diferentes etapas de la reparación de heridas (Figura 3). Usando una combinación de contraste de interferencia diferencial (DIC) y microscopía de fluorescencia, es posible medir parámetros distintos de la reparación de heridas. Con el fin de determinar si o no la reparación de heridas siguió un patrón reproducible a través de experimentos, el tiempo para restablecido el flujo de sangre se midió en 4 grupos de peces. Lesión de los vasos resultó en una respuesta estereotipada fiable de 253 ± 16 min para el restablecimiento del flujo sanguíneo a través del vaso herido (n = 4-5 peces por experimento, media ± SEM).

Figura 1: Diagrama del embrión 2 dpf muestra la colocación de pin minucias para perf orming lesión mecánica de la vena caudal (CV). compartimento vascular está sombreado en gris.

Figura 2: los tiempos de sangría pueden medirse visualmente después de lesión mecánica Stills de vídeo en tiempo real de la lesión del vaso pez cebra en 2 dpf embriones.. Las imágenes se muestran en el momento de la lesión (A), durante la pérdida de sangre activa de la herida (B), y después del cese de la pérdida de sangre (C). Todos los tiempos indicados son en cuestión de segundos. Los embriones se orientan lateralmente con anterior en la superficie superior y ventral mirando hacia la izquierda. Barra de escala 100 micras. La administración de la hirudina anticoagulante condujo a un aumento significativamente los tiempos de sangrado en comparación con el control del vehículo (D) (p <0,0001, prueba t de Student).pg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3:. La visualización de la lesión mecánica y reparación utilizando marcadores transgénicos Stills de timelapse DIC y microscopía de fluorescencia después de la lesión del vaso utilizando marcadores para endotelio vascular (kdrl: EGFP) y las células rojas de la sangre (gata1a: DsRed) en 2 dpf embriones. Imágenes mostraron una brecha en buques y acumulación local de glóbulos rojos (t = 25), la reparación parcial con restableció el flujo sanguíneo (t = 210), y la restauración completa de la estructura aparentemente vaso normal (t = 615). El tiempo se indica en minutos. Los embriones se orientan lateralmente con anterior en la superficie superior y ventral mirando hacia la izquierda. * Indica la posición de la aorta dorsal. La lesión (punta de flecha) interrumpe la vena caudal y parte del plexo caudal. Escalabar 25 m.

El pez cebra se han utilizado con éxito como un modelo para diferentes tipos de heridas incluyendo lesiones láser ^13-15, trombosis inducida por láser ^16, y epitelial hiriendo a ^10. Se presenta un método de la herida mecánico que es fácil de ejecutar y produce una lesión controlada en un modelo in vivo que es altamente susceptible a la microscopía en tiempo real. Lesión resulta en una respuesta hemostática rápido y medible y un programa de reparación de heridas reproducible que puede controlarse mediante microscopía de vídeo y timelapse.

Su anatomía simple y estereotipado vascular, que permite lesión reproducible en un sitio definido y microscópicamente accesible, y la presencia de más vascular y tipos de células hematopoyéticas hacen de embriones de pez cebra particularmente útil para estudiar las respuestas a las lesiones. Sin embargo, los embriones de pez cebra no tienen linfocitos funcionales durante las primeras semanas de desarrollo ^5,6, haciendo de este sistema más apapro- para el estudio de la contribución de la inmunidad innata en la inflamación y reparación. En la actualidad, existe una amplia variedad de pez cebra transgénico con marcadores para las células y proteínas que participan en la formación de trombos, la coagulación, la inflamación y la reparación de heridas, incluyendo las líneas que etiquetan trombocitos, fibrinógeno, eritrocitos, leucocitos y endotelio vascular ^{17,21,25- 31.} Estas y otras herramientas deberían permitir a seguir procesos que intervienen en la hemostasia y la reparación en detalle significativo.

Lesión mecánica complementa lesión láser para el estudio de la hemostasia en el pez cebra. Si bien la lesión inducida por láser se ha utilizado durante años para desencadenar la formación de trombos en embriones de pez cebra y modelos de ratón, los mecanismos por los que la lesión láser desencadena la coagulación y la activación plaquetaria / plaquetas no se conocen completamente ^16,32. Lesión mecánica proporciona un método fisiológicamente relevante para inducir la coagulación por incumplimiento vascular y, presumiblemente,factor tisular dependiente de la iniciación de la cascada de la coagulación. El hallazgo de que el tratamiento hirudina aumentó significativamente los tiempos de sangrado después de una lesión sugiere que este modelo es dependiente de trombina. Lesión mecánica complementa, además, lesiones láser proporcionando interrupción suficiente de un vaso sanguíneo para proporcionar una oportunidad de seguir la reparación de buques. Estudios previos han utilizado con éxito el daño mecánico por incisión bisturí y punción con aguja para mostrar las diferencias en los tiempos de sangrado en las condiciones de manipulación farmacológica y genética ^19,33. La lesión pin minucias utilizada en el modelo actual puede complementar otros modelos de lesión, proporcionando una lesión más reproducible debido al tamaño pequeño y definido de la herida que produce y proporcionando una oportunidad de estudiar mejor recanalización y reparación de buques.

Epitelial hiriendo en el pez cebra ha demostrado ser un poderoso modelo para el estudio de la inflamación y la herida de reparación ^10. La capacidad deintroducir una lesión vascular ofrece una oportunidad para evaluar la reparación de más heridas complejas en entornos donde la fibrina proporciona una matriz provisional, trombos y los residuos se eliminan, y los buques de regenerar. Como estos procesos participan en la reparación normal de tejidos y en la inflamación aguda y crónica y la patología vascular, este método debería ayudar a modelar aspectos de la enfermedad humana en un sistema en comportamientos celulares se pueden monitorizar en tiempo real en un modelo animal completo.