Mekanisk karskade i zebrafisk embryoner

BEMÆRK: Procedurer ved hjælp zebrafisk blev godkendt af UCSF Institutional Animal Care og brug Udvalg.

1. Fremstilling af værktøj

1. Sæt minutia pin ind i en pin holder og klemme tappen.
2. Brug fin spids pincet forsigtigt bøje spidsen af ​​stiften for at skabe en lille krog.
3. For manipulation og stabilisering af embryonet under skaden, bøje enden af ​​en 28 gauge ½ tomme nål monteret på en insulinsprøjte hjælp nåletang.

2. Fremstilling af zebrafisk embryoner til skade

1. Opsætning zebrafisk ynglepar og indsamle æg i æg vand (60ug / ml akvarium salte) som vist tidligere ^22.
2. Tilføj 0,003% N-phenylthiourinstof (PTU) til ægget vand, når embryonerne er ca. 8 timer efter befrugtning (HPF) for at forhindre melanin.
3. Dechorionate to dage efter befrugtning (DPF) embryoner før forsøget med fin spids pincet.
   
4. Bedøve embryoner med 0,02% pufret 3-aminobenzoesyre (tricaine) ca. 10 min forud for manipulationer.

3. Mekanisk karskade af embryoner

1. Overførsel bedøvede embryoer en depression slide på en dissekere stereomikroskop ved hjælp af en transfer pipette.
2. Brug af korte flade side af kanylen at manipulere embryo med den dominerende hånd, placere embryonet på sin side med den ventrale overflade vender bort fra nålen.
3. Placer minutia pin med spidsen pegede direkte mod den ventrale overflade af fisken posteriort for urogenitale åbning. Placer minutia stift ved en lille vinkel, således at den buede spids er i stand til at gennemtrænge den periderm direkte ind i halevenen (figur 1 </ Strong>).
4. Brug kanylen at manipulere embryo, gennembore halevenen med minutiaernes pin ved at trykke på embryo i stiften til lidt hook stiften ind i venen.
5. Brug kanylen, trække fosteret væk fra minutia pin til at skabe en lille tåre i beholderen.
   BEMÆRK: En vellykket skade vil resultere i øjeblikkelig blødning fra venen.

4. Analyse af Hæmostase

1. Vælg kun embryoner med synligt cirkulerende blodceller til denne procedure.
2. Forbered at starte timeren, så snart minutiaernes pin trækkes fra beholderen.
3. Starte timeren, så snart blodtab kan visualiseres fra såret. Når blodtab fra såret ophører, stoppe uret og registrere den samlede tid som blødningstiden. Hvis koagulation er hæmmet, registrere den tid til, når der ikke længere er synligt cirkulerende blodceller.

5. Analyse af sårheling

1. Transfer post-skade dyr på glas-bottom imaging retter til mikroskopi.
2. Fjern hovedparten af ​​ægget vand.
3. Dæk embryoner i 0,3-1,2% lavtsmeltende agarose opløst i æg vand, opvarmet til mellem 42 og 45 ºC og suppleret med 0,02% tricaine.
4. Position embryoner på deres sider ved hjælp pincet.
5. Efter agarose køler, skålen fyldes med 0,02% tricaine i æg vand.
6. Anskaf billeder ved hjælp af brightfield, epifluorescens eller konfokal mikroskopi.
7. Fjern embryo fra agarose med pincet og overføre tilbage til æg vand.

Mekanisk fartøj skade blev udført på 2 dpf embryoner (figur 2A - C). Skade resulterer i en hurtig og pålidelig koagulation respons målt som tid til ophør af blødning (figur 2D). For at bestemme hvorvidt eller ikke kunne måles forskelle i koagulation reaktion blev antikoagulerende hirudin administreres til embryonerne ved injektion ind i kanalen af ​​Cuvier umiddelbart inden sårdannelse (5-10 nl 1 enhed pr pi hirudin opløst i vand) (for demonstration af injektioner i Duct af Cuvier, se tidligere JOVE artikel ^{23) 24.} Administrationen af hirudin før skaden medførte signifikant forøget blødning gange versus køretøj kontrol (figur 2D).

Bevis for skader fartøj og koagulering kan ses umiddelbart efter skaden ved hjælp af transgene linjer for endotel (kdrl: EGFP) og røde blodlegemer (gata1a: dsRed 25,26. Billeder er erhvervet successivt hver 5 min i en 12 hr periode ved hjælp epifluorescens. Repræsentant stillbilleder vises i hele forskellige stadier af sårheling (figur 3). Ved hjælp af en kombination af kontrast forskellen interferens (DIC) og fluorescensmikroskopi, er det muligt at måle forskellige parametre sårheling. Med henblik på at afgøre, om sårheling fulgte en reproducerbar mønster på tværs af forsøg blev tid til at genetableret blodgennemstrømning målt i 4 grupper af fisk. Karskade resulterede i en pålidelig stereotype respons på 253 ± 16 min til genoprettelse af blodstrømmen gennem den sårede beholder (n = 4-5 fisk pr eksperiment, gennemsnit ± SEM).

Figur 1: Diagram over 2 dpf embryo viser placering af minutia pin for perf orming mekanisk skade af halevenen (CV). Vaskulær rum er skraveret med gråt.

Figur 2: Blødning tider kan visuelt måles efter mekanisk skade Stills fra real-time video af zebrafisk fartøj skade den 2. dpf embryoner.. Billederne vises på tidspunktet for skade (A), under aktiv blodtab fra såret (B), og efter ophør af blodtabet (C). Alle tider er angivet, er i sekunder. Embryoner er orienteret sideværts med anterior på top og ventrale overflade, der vender mod venstre. Scale bar 100 pm. Administration af den antikoagulerende hirudin medførte signifikant forøget blødningstider versus kontrol køretøj (D) (p <0,0001, T-test).pg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3:. Visualisere mekanisk skade og reparation ved hjælp af transgene markører Stills fra timelapse DIC og fluorescensmikroskopi efter karskade hjælp markører for vaskulær endotel (kdrl: EGFP) og røde blodlegemer (gata1a: dsRed) i 2 dpf embryoner. Billeder viste et hul i skibe og lokale røde blodlegemer akkumulering (t = 25), delvis reparation med re-etablerede blodgennemstrømning (t = 210), og tilsyneladende fuldstændig genoprettelse af normal fartøj struktur (t = 615). Tiden angives i minutter. Embryoner er orienteret sideværts med anterior på top og ventrale overflade, der vender mod venstre. * Angiver placeringen af ​​den dorsale aorta. Skaden (pilespids) forstyrret halevenen og en del af den kaudale plexus. Scalebar 25 um.

Zebrafisk er blevet anvendt med succes som en model for forskellige typer af sår, herunder laser skade ^13-15, laser-induceret trombose ¹⁶ og epithelial sårede ^10. Vi rapporterer en fremgangsmåde til mekanisk såring, der er enkel at udføre og giver en kontrolleret skade i en in vivo-model, der er meget modtagelig for real-time mikroskopi. Skade resulterer i en hurtig og målbar hæmostatisk respons og en reproducerbar sår reparation program, der kan overvåges ved hjælp af video og timelapse mikroskopi.

Deres enkle og stereotyp vaskulær anatomi, som tillader reproducerbar skade ved en defineret og mikroskopisk tilgængelig site, og tilstedeværelsen af ​​de vaskulære og hæmatopoietiske celletyper gøre zebrafisk embryoner særligt anvendelige til at studere responser på skade. Men zebrafisk embryoner ikke har funktionelle lymfocytter i de første uger af udviklingen ^5,6, hvilket gør dette system mest apmæssig til at studere bidrag medfødte immunitet i inflammation og reparation. I øjeblikket kan en bred vifte af transgene zebrafisk eksisterer med markører for celler og proteiner, der deltager i thrombedannelse, koagulation, inflammation og sårheling, herunder linjer, som mærker thrombocytter, fibrinogen, erytrocytter, leukocytter og vaskulære endotel ^{17,21,25- 31.} Disse og andre værktøjer bør gøre det muligt at følge processer, der er involveret i hæmostase og reparation i betydelig detalje.

Mekanisk skade supplerer laser skade for studiet af hæmostase i zebrafisk. Mens laser-induceret skade har været brugt i årevis til at udløse trombedannelse i zebrafisk embryoner og musemodeller, de mekanismer, hvormed laser skade udløser koagulation og thrombocytproduktion / blodpladeaktivering er ikke helt kendt ^16,32. Mekanisk skade giver en fysiologisk relevant metode til at inducere koagulation ved vaskulær brud og formodentligtissue-faktor-afhængige initiering af koagulationskaskaden. Konstateringen af, at hirudin behandling steg betydeligt blødningstider efter skade tyder på, at denne model er thrombin-afhængig. Mekanisk skade derudover supplerer laser skade ved at give tilstrækkelig forstyrrelse af et blodkar til at give mulighed for at følge fartøj reparation. Tidligere undersøgelser har med succes brugt mekanisk skade ved skalpel snit og nål punktering at vise forskelle i blødningstider under forhold med farmakologisk og genetisk manipulation ^19,33. Den minutia pin skade, der anvendes i den nuværende model kan supplere andre skade modeller ved at give en mere reproducerbar skade på grund af den lille og defineret størrelse af såret, den producerer, og ved at give mulighed for bedre at studere fartøj rekanalisering og reparation.

Epithelial sårdannelse i zebrafisk har vist sig at være en kraftfuld model til undersøgelse af inflammation og sårheling ^10. Evnen til atindføre en vaskulær skade giver en mulighed for at vurdere reparation af mere komplekse sår i miljøer, hvor fibrin giver en foreløbig matrix, tromber og snavs er ryddet, og fartøjer regenerere. Da disse processer deltager i normalt væv reparation og i akut og kronisk inflammation og vaskulær patologi, bør denne metode med til at modellere aspekter af menneskelig sygdom i et system, hvor cellulære adfærd kan overvåges i realtid i en hel dyremodel.