In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.
심층 암세포 프로테옴 분석은 종양 pathomechanisms 해명뿐만 아니라 잠재적 인 약물 표적 및 진단 바이오 마커를 식별하는 데 필요하다. 그러나, 환자 유래의 종양, 특히 자신의 세포 개체군에서 정량 프로테오믹스 특성화하기위한 방법은 크게 부족하다. 여기에서 우리는 액체 또는 고체 종양 중 하나에서 파생 된 암 세포 개체군의 프로테옴의 정량 분석을 허용하는 실험 장치에 대해 설명합니다. 이는 생물 정보학적인 데이터 분석 하였다 정량적 슈퍼 SILAC 계 질량 분석법으로 세포 농축 전략을 조합함으로써 달성된다. FACS – 정렬 한 다음 세포 계측법 특정 세포 하위 집합을 풍부하게하기 위해, 액체 종양은 제 1 유동에 의해 immunophenotyped된다 고형 종양에 대해, 레이저 캡처 미세 절제는 특정 세포 개체군을 정화하는 데 사용됩니다. 제 2 단계에서, 정제 된 단백질이 세포로부터 추출되고이어서 암 특이 적 결합,단백질 정량을 가능하게 스파이크 표준을 SILAC 표지. 생성 된 단백질 혼합물을 겔 전기 영동 또는 트립신 분해를 돕는 뒤에 필터 시료 준비 (FASP) 중 실시된다. 마지막으로, 트립신 펩티드 하이브리드 orbitrap 극자 질량 분광계를 이용하여 분석하고, 얻어진 데이터는 MaxQuant 포함한 생물 정보학 소프트웨어 군으로 처리된다. 8,000 단백질까지, 여기에 제시된 방법의 흐름에 의해 식별 될 수 있고, 환자 유래의 시료의 정량하고, 얻어진 단백질 발현 프로파일 진단 단백체 서명 또는 잠재적 약물 표적을 식별하는 환자 중 비교 될 수있다.
질량 분석 기반 단백질 체학 (proteomics)가 등장했다 및 세포 생물학 및 병진 생물 의학 연구에 널리 사용되는 분야는 지금이다. 단백질 수천 번의 질량 분석 실험 1,2-에서 식별 될 수있는 기술 분야에서의 진보는 세포주 및 동물 모델에서 복잡한 세포 과정을 연구하는 것이 가능했다. 이것은 일반적으로 변성 2,3- 유형별 농축 및 데이터 분석을 위해 주문 된 워크 플로우가 필요하지만 유사하게 진행, 예컨대 인산화 또는 유비퀴틴 많은 번역 후 변형의 분석을했다. 또한, SILAC를 포함하여 화학 및 신진 대사 라벨링 전략의 참여는 인간의 암 4의 기본 세포 과정, 진단 바이오 마커 및 잠재적 인 약물 표적의 발견이 방법은 특히 매력적인 만드는 단백질과 PTMS의 정확한 상대 정량화 할 수 있습니다.
그러나,여러 과제 일차 인간 암 (5)의 프로테옴 해석에 관해서 극복되어야한다. 첫째, 인간의 암 샘플은 종종 면역 세포와 섬유 아세포를 포함한 종양 미세 환경에 속하는 다양한 유형의 세포의 존재로 인해 세포 이질성 고도를 나타낸다. 둘째, 클론 진화는 별개의 기능적 특성과 여러 세포 개체군의 존재의 결과로, 자신 종양 내에서 유전 적 다양성에 연결됩니다. 암 발생 및 진행, 예컨대 (기능적 관련성) 세포 개체군의 프로테옴 분석 뒤에 구동력 인 몇 암 줄기 세포의 현재의 개념에 따르면, 임상 적 적용에 대한 중요한 발암 기전의 더 나은 이해를 위해 매우 중요 할 것으로 예상된다 6. 셋째, 많은 양의 샘플 세트들의 정량적 단백질 발현 프로파일은 종종 강력한 임상 BIOMAR의 식별에 필요한KERS; 의존 그들이 같은 세포 증식 4에서, – – 마찬가지로 대상 외 대사 표지 전략이 동안, 예컨대 7 iTRAQ 화학적 라벨링함으로써 달성 될 수 없다. 넷째, 가장 가능한 고형 종양 샘플은 포르말린 고정 의한 가교 단백질 (8)의 형성에 질량 분석 프로테옴 해석을 복잡하게한다. 마지막으로, 대부분의 기존 프로테오믹스 흐름이 곤란 임상 연구에 대한 중요한 시료 번호의 렌더링 분석 시료 처리 및 데이터 수집의 상당한 양을 요구하고, 새로운 워크 플로우를 요구하면 9,10 패러다임.
이러한 장애를 해결하기 위해 우리는 포괄적 인 질량 분석에 대한 글로벌 내부 표준을 소개하는 슈퍼 SILAC (14) 전략과 세포 농축을 위해 11 레이저 캡처 미세 절제 12, 13 정렬 중 하나 유세포 셀을 결합하는 실험 장치를 개발. 여기에 기술 된 방법을 사용함으로써, 액체 또는 고체의 암 중 하나로부터 유도 된 인간 종양 샘플에서 8000까지 단백질 정량화 할 수있다.
환자 유래의 암 세포 프로테옴의 질량 분석 프로파일은 새로운 진단 / 예측 바이오 마커 발견에 필요할뿐만 아니라 암세포 생물학의 더 나은 이해를 제공 할 수도 새로운 잠재적 인 약물 타겟들의 식별에 차례 리드. 다양한 사전 분석 문제 하나가 견고하고 생물학적으로 중요한 결과를 얻을 경우, 해결되어야 할 필요가 있기 때문에, 이러한 질량 분광 분석은 특히, 매우 도전적이다.
여기에 설명 된 실험적인 작업 흐름은 액체 및 고체 종양 모두의 세포 개체군에서 파생 된 프로테옴의 정량 프로테오믹스 특성화 수 있습니다. 어느 FACS 기반 셀 sortingor의 미세 절제함으로써 종양 세포의 농축은 초기 종양 미세 환경의 세포에 의한 오염을 방지하기 위해 필요하다. 또한, 이들 기술은 하나의 세포가 관심 개체군을 분리 할 수있다. 최근 세포 생물학적 연구는 악마가특정 세포 개체군이 종양을 시작하는 특성을 가지고있어 암 발병 (19, 20)에 대한 관련성이 높은 것을 strated. 질량 분석은 최근 몇 년 동안 더 민감하게되면서, 양적 프로테옴 분석은, 몇 천 세포로부터 유도 될 수있다 단백질의 소량을위한 실현 가능한 것이 가능 기능적으로 관련 세포 집단에 초점을 할 수있다.
여기에 제시된 셋업은 FFPE 시료에서 신규 진단 바이오 마커를 식별하고 검증하는 데 사용될 수있다. 따라서, 여전히 많은 유형의 암 및 적절한 수의 품질 분자 바이오 마커의 부족으로 현재까지 임상 진단의 개선을위한 유용한 도구 BEA 약속. 바이오 마커가 부족하는 어려운 차동 진단의 중요한 예는 폐에 전이, intrapancreatic cholangiocellular 암 및 췌장 선암에서 원발성 폐암 사이의 차별이다,뿐만 아니라 다른고도의 악성 말초 신경 칼집 종양에서 양성 신경 섬유종의 entiation. 또한, 우리는 다른 사람의 서명 단백질체 정량 해명은 일반적으로 암 세포 생물학 연구 및 암 환자에서 치료 적 응답 (21)의 예측을위한 바이오 마커를 드러내는 유용 할 수 있음을 보여 주었다.
여기에 제시된 방법의 단점은 두 개의 전류 광범위한 설명서 시료 처리에 대한 요구 및 nanoLC-MS / MS 획득 시간에 대한 요구이다. 전자는 예를 들어, 96 웰 형식으로 시료 전처리를 이동 로봇 및 프로세싱을 사용하여 해결 될 수 있지만, 후자는 질량 분석 인수 전략의 변경을 요구할 것이다. 표적 단백질의 서브 세트는 예를 들면, 종양의 분류와 연관 될 수있는 식별되고 나면, 우리는 매우 감소 분리 노력이 서브 세트에 대한 판독 값을 제공하는 정량 대상 질량 분석 방법의 설계를 직시 한따라서 대응하여 획득 시간 감소와. (24)로부터 감소 될 수있다 요구되는 필요한 수집 시간 경우 – 36 시간 (액체 종양) 또는 3 시간 (고형 종양)을 예 :하기 1 시간 후 질량 분석 및 펩티드의 단순한 일차원 분리, 처리량 얻어진 이득을 타겟팅 사용 하 정량 결과의 유의성 개선 대응하는, 생물학적 검사 기술 복제물 유의 숫자를 증가하는데 사용될 수있다. 타겟 질량 분석 방법은 이미 암 관련 단백질 바이오 마커 – 후보 (22)의 검증을위한 적절한 도구로 입증되었다, 그들은 검증 또는 심지어 루틴 임상 23 전위 도구로 약속 표시 점 개발되어왔다 24.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia Münch for technical support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
660 nm Kit | Thermo scientific | 22662 | |
Cell culture medium depleted of arginine and lysine | Thermo Scientific | 88421 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution | Bio Rad | 161-0436 | |
Dialyzed fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-107 | |
Diffuser caps for microdissection | MMI | 50202 | |
FACS-sorter | BD | FACSAria III | |
Ionic Detergent Compatibility Reagent | Thermo scientific | 22663 | |
Laser-capture microdissector | MMI | cell cut plus | |
LDS buffer | Life Technologies | NP0009 | |
Membrane slides for microdissection | MMI | 50103 | |
Microcon YM-30 | Millipore | MRCF0R030 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels | Life Technologies | NP0335PK2 | |
Picofrit Self-Pack Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | Mass Spectrometry Column/Emitter |
Reducing agent | Life Technologies | NP0007 | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 3 µm | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 5 µm | |
SILAC-labeled arginine | Eurisotop | CLM-2265-H-0.1 | |
SILAC-labeled lysine | Eurisotop | DLM-2640-0.25 | |
Trypsin, NB Sequencing Grade | Serva | 3728301 | for in-gel digests |
Trypsin, Sequencing Grade | Promega | V5111 | for in-solution digests |
Buffer and solutions | |||
Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF, 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4 | |||
Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT | |||
Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
0.05 M NH4HCO3 | |||
10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
5% aqueous formic acid. |