In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.
In eingehenden Analysen der Krebszelle Proteome sind erforderlich, um onkogene Pathomechanismen aufzuklären, aber auch, um potenzielle Zielmoleküle und diagnostische Biomarker zu identifizieren. Jedoch sind Verfahren zum quantitativen Proteom-Charakterisierung von Patienten stammende Tumoren und insbesondere ihre zellulären Subpopulationen weitgehend. Hier beschreiben wir eine Versuchsanordnung, die quantitative Analyse der Proteome von Krebs Zell-Subpopulationen von entweder flüssigen oder festen Tumoren abgeleitet werden können. Dies wird durch die Kombination von Zellanreicherungsstrategien mit quantitativen Super SILAC basierte Massenspektrometrie gefolgt von bioinformatischen Datenanalyse erreicht. Um bestimmte zelluläre Untergruppen bereichern werden flüssige Tumoren zunächst durch Fließ immunophenotyped Zytometrie durch FACS-Sortierung gefolgt; bei soliden Tumoren wird laser Mikrodissektion verwendet, um bestimmte Zellpopulationen zu reinigen. In einem zweiten Schritt werden die Proteine aus den gereinigten Zellen extrahiert und anschließend mit einem tumorspezifischen kombiniert,Spike-In-Standard, der Proteinquantifizierung ermöglicht SILAC-markiert. Das resultierende Protein Mischung wird entweder Gelelektrophorese oder Filter Aided Probenvorbereitung (FASP), gefolgt von tryptischen Verdau unterzogen. Schließlich werden tryptischen Peptide mit einem Hybrid-Quadrupol-Orbitrap Massenspektrometer analysiert, und die erhaltenen Daten werden mit Bioinformatik-Software-Suiten, einschließlich MaxQuant verarbeitet. Mittels der hier dargestellten Arbeitsablauf bis zu 8.000 Proteinen identifiziert werden können und in einem Patienten stammenden Proben quantifiziert werden, und die resultierenden Proteinexpressionsprofile kann bei Patienten zu Diagnose proteomic Signaturen oder mögliche Wirkstoffziele zu identifizieren, verglichen werden.
Die Massenspektrometrie-basierte Proteomik entstanden und ist heute eine weit verbreitete Disziplin in der Zellbiologie und translationalen biomedizinischen Forschung. Der technische Fortschritt in diesem Gebiet haben es möglich, komplexe zelluläre Prozesse in Zelllinien und Tiermodellen zu untersuchen gemacht, da Tausende von Proteinen in einer einzigen massenspektrometrischen Experiment 1,2 identifiziert werden. Ähnliche Fortschritte bei der Analyse für viele posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung oder Ubiquitinierung gemacht worden, obwohl dies erfordert in der Regel maßgeschneiderte Abläufe für die Anreicherung und die Datenanalyse für jede Art von Modifikation 2,3. Darüber hinaus ist die Beteiligung von chemischen und metabolischen Markierung Strategien, einschließlich SILAC, ermöglicht eine genaue relative Quantifizierung von Proteinen und PTMs, so dass dieses Verfahren besonders für die Entdeckung der grundlegenden zellulären Prozesse, diagnostische Biomarker und potenzielle Angriffspunkte für Arzneimittel in menschlichen Krebs 4 attraktiv.
Jedochmehrere Herausforderungen müssen hinsichtlich Proteom-Analyse von primären humanen Krebs 5 überwunden werden. Zunächst zeigen menschliche Krebsproben oft einen hohen Grad an zellulärer Heterogenität, die durch die Anwesenheit verschiedener Zellentypen in der Tumor-Mikroumgebung, einschließlich Immunzellen und Fibroblasten gehör. Zweitens führt klonalen Evolution die genetische Vielfalt innerhalb der Tumoren selbst, was in der Existenz mehrerer Zellpopulationen mit unterschiedlichen funktionellen Eigenschaften. Nach dem derzeitigen Konzept der wenigen Krebsstammzellen als die treibenden Kräfte bei der Krebsentstehung und Progression, Proteomanalyse eines solchen (funktional höchst relevant) Zellpopulationen wird erwartet, dass von großer Bedeutung für ein besseres Verständnis der onkogenen Mechanismen für die klinische Anwendung relevant sein 6. Drittens werden quantitative Proteinexpressionsprofile von großen Sätzen von Proben oft zur Identifizierung robuste klinische Biomar erforderlichekers; Dies kann nicht durch chemische Markierung wie iTRAQ 7 durchgeführt werden, während die metabolische Markierung Strategien – die sich, wie sie es tun, auf die zelluläre Proliferation 4 – sind ebenfalls nicht anwendbar. Viertens sind die meisten verfügbaren festen Tumorproben in Formalin fixierten, die massenspektrometrische Proteomanalyse aufgrund der Bildung von Proteinquervernetzungen 8 verkompliziert. Schließlich sind die meisten bestehenden Proteomik Workflows erfordern erhebliche Mengen an Probenverarbeitung und Datenerfassung, wodurch die Analyse der Probennummern für die klinische Forschung relevanten schwierig und fordern neue Workflow-Paradigmen 9,10.
Um diese Hindernisse zu adressieren wir einen Versuchsaufbau, die entweder durchflusszytometrische Zell kombiniert Sortier 11 oder Laser-Mikrodissektion 12,13 für die Zellanreicherung mit einem Super SILAC 14 Strategie, ein globales interner Standard für eine umfassende massenspektrometrische Analyse einzuführen entwickelt. Durch die Verwendung der hier beschriebenen Verfahren ist es möglich, bis 8.000 Proteine in einzelnen menschlichen Tumorproben von entweder flüssigen oder festen Krebsarten abgeleitet quantifizieren up.
Massenspektrometrische Analyse von Patienten stammende Krebszell Proteome wird für die Entdeckung neuer diagnostischer / prädiktive Biomarker benötigt, als auch zu einem besseren Verständnis von Krebs-Zellbiologie, geben, die vielleicht wiederum zu der Identifizierung von neuen potenziellen Wirkstoff-Targets. Allerdings sind solche massenspektrometrische Analysen sehr anspruchsvoll, vor allem, weil verschiedene präanalytische Probleme müssen gelöst werden, wenn man sich um robuste und biologisch relevante Ergebnisse zu erhalten.
Die hier beschriebenen experimentellen Arbeitsablauf ermöglicht quantitative Proteomik Charakterisierung von Proteomen von zellulären Subpopulationen von flüssigen und festen Tumoren abgeleitet. Die anfängliche Anreicherung von Tumorzellen entweder durch FACS-basierte Zell sortingor Mikrodissektion benötigt wird, um eine Verunreinigung durch Zellen der Tumormikroumgebung zu vermeiden. Darüber hinaus sind diese Techniken erlauben es, zelluläre Subpopulationen von Interesse zu isolieren. Neueste zellbiologische Studien haben Dämonstrated, dass bestimmte Zellpopulationen haben tumorauslösende Eigenschaften und sind somit für die Krebs Pathogenese 19,20 höchst relevant. Massenspektrometrie sensibler geworden in den letzten Jahren sind quantitative proteomische Analyse denkbar, dass die geringen Mengen an Protein, das von einigen tausend Zellen abgeleitet werden können, was es ermöglicht, den Schwerpunkt auf die funktionsrelevanten Zellpopulationen.
Die Einrichtung hier vorgestellten kann verwendet werden, um in FFPE-Proben Identifizierung und Validierung neuartiger diagnostischer Biomarker werden. Daher verspricht sie nützliches Werkzeug für die Verbesserung der klinischen Diagnostik BEA, als bisher gibt es noch ein Mangel an molekulare Biomarker in ausreichender Zahl und Qualität für viele Krebsarten. Wichtige Beispiele für schwierige Differentialdiagnosen, für die Biomarker fehlen, sind die Unterscheidung zwischen primären Lungenkrebs von Metastasen in der Lunge, intrapankreatischen cholangiozelluläres Karzinom und Adenokarzinom des Pankreas sowie unterscheidenzierung von gutartigen Neurofibrom von hoch malignen peripheren Nervenscheidentumoren. Darüber hinaus haben wir und andere haben gezeigt, dass quantitative Aufklärung der Proteom-Signaturen können bei der Untersuchung von Krebszellen Biologie im Allgemeinen und für die Entdeckung prädiktiver Biomarker für therapeutische Reaktion bei Krebspatienten 21 Jahre alt sein.
Zwei aktuelle Nachteile der hier vorgestellten Verfahren sind die Voraussetzung für umfangreiche manuelle Probenaufbereitung und die Nachfrage am nanoLC-MS / MS Erfassungszeit. Während erstere können durch Bewegen der Probenvorbereitung bis zum Beispiel 96-Well-Format und mit Roboter gewandt werden, wird dieser eine Änderung der massenspektrometrischen Akquisitionsstrategie benötigen. Nach Teilmengen von Zielproteine identifiziert, die mit zB Tumorklassifikation in Verbindung gebracht werden können, sehen wir die Gestaltung von gezielten Massenspektrometrie Methoden, die quantitative Ablesungen für diese Teilmengen mit einem stark reduzierten Trennaufwand zu schaffen, unddaher mit einem entsprechend reduzierten Akquisitionszeit. Falls die benötigte Erfassungszeit benötigt konnte von 24 reduziert werden – 36 h (flüssige Tumoren) oder 3 Stunden (solide Tumoren), um zB, 1 h durch gezielte Massenspektrometrie und eine einfache eindimensionale Trennung von Peptiden, wird der daraus resultierende Gewinn im Durchsatz könnte verwendet werden, um wesentlich die Anzahl von biologischen und technischen Wiederholungen geprüft zu erhöhen, mit entsprechenden Verbesserungen in der Bedeutung der Quantifizierungsergebnisse werden. Gezielte massenspektrometrische Ansätze wurden bereits gezeigt, dass sie ein geeignetes Instrument für die Überprüfung der Krebs assoziiertes Protein-Biomarker-Kandidaten 22 zu sein, und sind an einem Punkt, wo sie Versprechen für die Validierung oder sogar als mögliches Instrument für die klinische Routineanwendung 23 zeigen entwickelt , 24.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia Münch for technical support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
660 nm Kit | Thermo scientific | 22662 | |
Cell culture medium depleted of arginine and lysine | Thermo Scientific | 88421 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution | Bio Rad | 161-0436 | |
Dialyzed fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-107 | |
Diffuser caps for microdissection | MMI | 50202 | |
FACS-sorter | BD | FACSAria III | |
Ionic Detergent Compatibility Reagent | Thermo scientific | 22663 | |
Laser-capture microdissector | MMI | cell cut plus | |
LDS buffer | Life Technologies | NP0009 | |
Membrane slides for microdissection | MMI | 50103 | |
Microcon YM-30 | Millipore | MRCF0R030 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels | Life Technologies | NP0335PK2 | |
Picofrit Self-Pack Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | Mass Spectrometry Column/Emitter |
Reducing agent | Life Technologies | NP0007 | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 3 µm | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 5 µm | |
SILAC-labeled arginine | Eurisotop | CLM-2265-H-0.1 | |
SILAC-labeled lysine | Eurisotop | DLM-2640-0.25 | |
Trypsin, NB Sequencing Grade | Serva | 3728301 | for in-gel digests |
Trypsin, Sequencing Grade | Promega | V5111 | for in-solution digests |
Buffer and solutions | |||
Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF, 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4 | |||
Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT | |||
Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
0.05 M NH4HCO3 | |||
10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
5% aqueous formic acid. |