液体および固形腫瘍由来の癌細胞のプロテオームの定量的質量分析プロファイリング

ヒト組織または血液サンプル上のすべての実験は、倫理委員会によって承認され、倫理の投票で与えられたすべてのガイドラインに従って実施されなければならない。 1.携帯濃縮液性腫瘍/蛍光活性化細胞選別。 塩化アンモニウムを用いて赤血球溶解を行うことによって、またはフィコール密度勾配遠心分離により、骨髄または血液サンプルから単核細胞を単離する。 赤血球溶解のために、塩化アンモニウム溶液4mlで1mlのサンプルを組み合わせる。 10分 – 5氷上で解決策をインキュベートします。 400×gで4℃でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）+ 2％ウシ胎児血清（FCS）、5分間遠心分離を40mlを加える。 フィコール勾配遠心分離、レイヤ2の異なる層を形成するためのフィコール – ハイパックの15ミリリットル上のサンプルの10ミリリットルのために（層を乱さないように注意してください）​​。 RTで30分間、400×gで遠心分離 – 慎重に（15〜25℃）および単核収穫間期に集まる細胞。 細胞をスピンダウンし、PBS + 2％FCSでそれらを取る。 5分間400×gで遠心分離し、1mlのPBS + 2％FCS中で占める。陰性対照として1アリコート、最終的な汚れで使用される各蛍光色素のための1アリコートを取る。 氷上で30分間、製造者の指示に従って希釈して、白血病細胞集団を単離するのに有用な蛍光標識抗体でインキュベートする。また、個別に各抗体との補償のために使用アリコートを染色。 PBS + 2％FCSで二回洗浄する。 注：使用される抗体は、CD117-PE（クローン95C3）、CD34-FITC（クローン8G12）とCD33-PE（クローンP67.6）に対するマウス抗ヒトだった。 理想的にキャップに統合セルストレーナーでチューブを使用して、35μmのセルストレーナーを通して細胞をフィルタリングします。 細胞生存性染色（ 例えば、7-AAD）を追加します。適切なセルソーター11（ 図2）を使用してソート細胞。 Iscの中で細胞を回収 10％FCSを含むオベ改変ダルベッコ培地（IMDM）。 固形腫瘍/レーザーキャプチャーマイクロダイセクション。 記載された実験では、肺癌試料からのFFPE試料を用いた。この目的のために、肺癌のための組織は直ちに外科的切除、さらなる分析のためにパラフィン中に包埋し、約3×1×2cmの断片から4％緩衝ホルマリン中で固定した。 ミクロトームとのホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）サンプルから10μmの厚さ – 5のセクションをカット。膜で覆われた膜のスライドと1時間37℃で乾燥した上で、マウント部分。脱パラフィンし、キシレン、無水エタノール、70％水での連続インキュベーションによって1分間の各マウント切片を再水和。 20秒間ヘマトキシリン​​でセクションを染色した後、水道水ですすいでください。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステムを用いて、目的の細胞集団を収集する（また、12を参照）。 タイトル "> 2。タンパク質抽出液性腫瘍。 400×gで、4分間、4℃でステップ1.1.5から細胞懸濁液を遠心し、上清を捨てる。 400×gで5分間500冷PBSのμLと遠心分離で二回洗浄し、4℃ （最小細胞数でなければなりません10 5細胞（約10μgの全タンパク質））10 6細胞あたり40μlの溶解バッファーを追加し、氷上で15分間インキュベートする。 14000×gで、10分間、4℃で溶解物を遠心し、新しい反応チューブに上清（クリア細胞溶解物）を転送する。ペレットを捨てる。 固形腫瘍。 顕微解剖組織に組織溶解バッファー60μlのを追加し、氷上で15分間インキュベートし、短い遠心分離によって流体を収集し、新たな反応チューブにサスペンションを移す。 3分間氷上で溶解液を超音波処理。 最終SDS共同達するまで、20％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の15μlを添加する4％のncentration。 1時間加熱ブロック中で99℃で顕微解剖し、組織をインキュベートし、600rpmで撹拌した。 16000×gで、10分間18℃で溶解液を遠心し、上清を新しいチューブに移す。 SILACスパイク·イン定量標準（スーパーSILAC標準）の3。設立 NOTE：定量標準は、4から導出SILAC標識タンパク質の混合物からなる – 関心の腫瘍タイプと一致6細胞株。 SILAC標識参照プロテオームおよび腫瘍由来のプロテオームの間の最大のオーバーラップを達成するために、主成分分析は、細胞株は、定量標準14のために選択される前に実行される必要がある。 主成分分析（PCA）。 細胞株のタンパク質発現パターンを決定するために、適切な細胞培養培地中で約10の異なる細胞株を育成。細胞を溶解説明したようにステップ2.1で。ステップ6.1で説明したように、質量分析のための細胞溶解物を準備します。 高分解能液体クロマトグラフィー結合質量分析計（ナノLC-MS / MS）の各細胞株のタンパク質の発現パターンを分析する。 無料のウェアMaxQuantを使用して結果の生データを分析し、ペルセウス16,17などの関連ソフトウェアを使用して、主要成分分析を行う。 それらのタンパク質発現プロファイルとの間の最大の多様性を示す6細胞株とスーパーSILACスパイクイン標準を生成するためにそれらを使用する – 4を選択。 SILAC標識およびラベルチェック。 アルギニンおよびリジンは、炭素と窒素（SILAC培地）4の安定同位体で標識された適切なSILACの細胞培養培地中の少なくとも5つの細胞周期のために選択された細胞株を育成。 溶解ステップ3.1で説明した、ステップ6.1で説明したように、質量分析のための細胞溶解物を準備として細胞。ナノLC-MS / MSによるSILACラベリングの取り込み効率を測定します。 MaxQuant得られた生のMSデータを分析し、SILAC標識の効率を決定する。これは、それらの標識された（重）で同定されたペプチドの数をカウントし、その内因性形態（光）との比（重）/（重+光）を計算することにより達成される。標識効率98％を超えなければならない。 SILACプロテオームと検証の組み合わせ。 育成と適切なSILAC培地で製造業者の指示に従って、選択された細胞株を展開します。溶解液性腫瘍のためのステップ2.1で、または固形腫瘍のためのステップ3.2で説明した各細胞溶解物についてのタンパク質濃度を決定するように説明したように細胞。 各細胞株の等モルタンパク質量を混合し、アリコートに混合物を分割します。測定まで-80℃でアリコートとストアをスナップ凍結。スーパーSILAC標準の50μgの – 1実験ではあなたが20を必要としています。スタンを準備するように注意してください一連の実験の範囲内標準を変更するなど、過剰でDARDは避けるべきである。 タンパク質濃度およびスパイクインの4。測定液性腫瘍。 タンパク質定量アッセイを使用すると、それぞれの細胞溶解物のタンパク質濃度とスーパーSILAC標準を決定する。 クリア細胞溶解物とスーパーSILAC規格の等量を混合し、続いてリチウムドデシル硫酸塩（LDS）緩衝液（試料体積の25％）と還元剤（サンプル体積の10％）を加える。 10分間72℃で加熱ブロック中で得られた溶液を加熱する。必要に応じて、-80℃で生じた変性タンパク質を保存する。 固形腫瘍。 プレートリーダー上でタンパク質濃度を測定するため、標準のウシ血清アルブミン（BSA）の希釈液シリーズ、市販のタンパク質aを有する溶解物および適切なスーパーSILAC標準を混ぜる96ウェルプレートにおいてssay、1分間振とう、指示された時間インキュベートし、製造業者によって示されるように吸光度を測定する。 注：溶解液中の高濃度のSDSおよびジチオスレイトール（DTT）は、タンパク質濃度測定のために最も利用可能なアッセイのための問題である。 清澄化ライセートを20℃で30分間、14000×gでフィルタユニットと遠心分離機の尿素を200μlとスーパーSILAC規格の等量を混合する。 50以上の明確化ライセートのμlのとスーパーSILAC規格を使用しないでください。尿素が出て結晶化しないように、15℃以下の温度を避けてください。 5.サンプル分離およびタンパク質消化物液性腫瘍。 個別の30 – 4上のレーンあたり100μgの総タンパク質 – 12％勾配SDS-PAGEゲル。クマシーブルーO / Nで染色タンパク質。水で2回洗浄し、その後の過剰クマシー染色を削除します。 ゲルから各レーンをカットし、それを分割23の同じサイズのスライスに関係なく、ゲル染色のパターンの。 0.6ミリリットルポリプロピレンバイアル中で、別々の各をゲルスライスを処理します。 水、メタノール/水でゲルスライスを洗浄し（50：50、v / v）で、56℃で30分間インキュベートすることによって、10mMのDTTを減らす。暗闇の中で、室温で60分でインキュベートすることによって、55mMヨードアセトアミド（IAA）でゲルスライスをアルキル化。 サンプル処理工程の間に、過剰の溶媒を除去し、試薬溶液の取り込みを改善することをSpeedVac中で15分間乾燥したアセトニトリルでスライスを洗浄する。 37℃で16時間（0.025 M水性重炭酸アンモニウム中12.5 ng /μl）をブタトリプシン溶液の最小量の乾燥したゲル切片を再水和することにより、プロテアーゼ切断を行う。 ゲル切片に10μlの水を加え、37℃で15分間インキュベートする。 80μlのアセトニトリルを加え、37℃で15分間インキュベートする。 1分間、15,800×gで遠心分離する。別々の0.6ミリリットルで上清とストアを収集チューブ。 、5％ギ酸溶液の65μlを加え、ボルテックスし、37℃で15分間インキュベートする。 65μlのアセトニトリルを加え、37℃で15分間インキュベートする。 1分間15,800×gで遠心分離する。上清を収集し、前のステップからの上清に追加します。真空濃縮器で乾燥するまで組み合わせた上清を蒸発。 固形腫瘍。 組織溶解物からSDSを除去するには、参照15のように説明されている次のFASPプロトコルを使用。 ステップ5.2.3で説明した第1の遠心分離した後、20℃で20分間14000×gでフィルター上に8 M尿素のさらなる200μlの、さらに遠心分離を追加。フロースルーろ液を捨てます。 100μlのIAAを加え、1分間600 rpmでサーモミキサーで混ぜる。暗所で20℃で20分間フィルターをインキュベートする。 20℃で10分間14000×gでフィルターを遠心。 フィルタとCENへの尿素100μlのを追加します。20℃で15分間14000×gでtrifuge、。この手順をもう一度繰り返します。 20℃で10分間14000×gでフィルターや遠心分離機にNH 4 HCO 3100μlのを追加。二回、この手順を繰り返します。 40μlのNH 4 HCO 3 + 1μL（= 0.4μgの）トリプシンを追加し、600 rpmで、1分間20℃のサーモミキサーで混ぜる。 37℃で湿ったチャンバー内でフィルターのO / Nをインキュベートする。新しいコレクションチューブにフィルターを転送します。 20℃で10分間14000×gでフィルターを遠心。 20℃で10分間14,000gでNH 4 HCO 3および遠心50μlのフィルタを追加する。質量分析測定まで-20°Cで得られたペプチドを保管してください。 ペプチド濃度の測定のため、96ウェルプレートに得られたフロースルーおよびニートトリプトファンの適切な希釈系列の50μLを分注する。トリプトファン蛍光を測定します。の結果の濃度を変換するトリプトファン0.1μgのようなペプチド濃度のトリプトファンは、9μgのタンパク質に対応している。 6.液体クロマトグラフィーおよび質量分光分析超音波処理浴中で5分間30μlのローディングバッファー中のペプチドを再溶解。 1分間15,800×gで遠心分離器でスピンダウンし、MSのオートサンプラーバイアル中に透明な溶液をピペット。 ナノLC-MS / MSシステムのオートサンプラーを用いた分析あたりのサンプルの5μLを注入。逆相でオンラインペプチドを濃縮し、脱塩C18プレカラム（0.15ミリメートル5μmの孔サイズのC18材料とID×20 mm）はベント列のセットアップや設定を切り替えるプレカラムどちらに搭載された。 逆相C18マイクロカラム上の別個のペプチドは（0.075g内径×200ミリメートル3μm以上対5> 35％のアセトニトリルの90分間の勾配を使用してこのようなPicoFritなどの自己パックナノスプレーカラム小さい細孔サイズC18材料、自己詰め300 NLで0.1％ギ酸水溶液/分。ナノスプレーイオン源によりハイブリッド四重極/オービトラップ質量分析計に溶離液を転送します。 Top15データ依存取得方法（MSのm / z範囲 350使用したペプチドの分析- 。1600、解像度ターゲット70.000 FWHM、AGC対象1×10 6、最大充填時間60ミリ秒をMS / MSは質量100の開始、解像度ターゲット17.500 FWHM、AGC 2×10 5を標的とする、最大時間を60ミリ秒を埋めるMS / MS閾値3×10 4、荷電状態2、 – 。5、正規化衝突エネルギーNCE 25％、動的排除15秒）。 7.データ解析データ分析のために自由に利用可能なMaxQuant 16ソフトウェアを使用しています。生物情報学的データ解析のための詳細なプロトコールは、16,17に記載されている。分析のために、単一の実験17にSDS-PAGEのレーンからのすべてのスライスからの生データファイルを結合する。