In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.
Des analyses approfondies des protéomes cellulaires de cancer sont nécessaires pour élucider pathomécanismes oncogènes, ainsi que d'identifier des cibles potentielles de médicaments et de biomarqueurs de diagnostic. Cependant, les méthodes de caractérisation protéomique quantitative des tumeurs provenant de patients et en particulier leurs sous-populations cellulaires font largement défaut. Nous décrivons ici un montage expérimental qui permet l'analyse quantitative des protéomes de sous-populations de cellules cancéreuses dérivées de soit des tumeurs liquides ou solides. Ceci est réalisé par la combinaison des stratégies d'enrichissement cellulaire avec la spectrométrie de masse à base de Super-SILAC quantitative suivie d'analyse bioinformatique des données. Pour enrichir sous-ensembles cellulaires spécifiques, tumeurs liquides sont d'abord immunophénotypés par cytométrie de flux suivie par FACS-tri; des tumeurs solides, microdissection par capture laser est utilisé pour purifier des sous-populations cellulaires spécifiques. Dans une deuxième étape, les protéines sont extraites à partir des cellules purifiées et ensuite combinés avec un spécifique d'une tumeur,SILAC marqué norme de pic-in qui permet la quantification des protéines. Le mélange de protéine ainsi obtenu est soumis à une électrophorèse sur gel ou l'autre filtre ou assistée Préparation d'échantillons (FASP) suivie d'une digestion trypsique. Enfin, les peptides tryptiques sont analysés en utilisant un spectromètre de masse quadripolaire Orbitrap-hybride, et les données obtenues sont traitées avec des suites de logiciels bioinformatiques y compris MaxQuant. Par le biais du flux de production présentée ici, jusqu'à 8000 protéines peuvent être identifiés et quantifiés dans les échantillons de patients dérivés, et les profils d'expression de protéines qui en résultent peuvent être comparés chez les patients pour identifier les signatures protéomiques de diagnostic ou de cibles potentielles de médicaments.
Protéomique par spectrométrie de masse a vu le jour et est maintenant une discipline largement utilisé en biologie cellulaire et de la recherche biomédicale translationnelle. Les progrès techniques dans le domaine ont permis d'étudier les processus cellulaires complexes dans des lignées cellulaires et des modèles animaux, que des milliers de protéines peuvent être identifiées dans une seule expérience de spectrométrie de masse 1,2. Des progrès similaires ont été réalisés pour l'analyse de nombreuses modifications post-traductionnelles comme la phosphorylation ou ubiquitination, bien que cela nécessite généralement workflows sur mesure pour l'enrichissement et l'analyse de données pour chaque type de modification 2,3. En outre, la participation des stratégies d'étiquetage chimiques et métaboliques, y compris SILAC, permet une quantification précise et relative de protéines et de PTM, ce qui rend cette méthode particulièrement intéressante pour la découverte des processus cellulaires de base, biomarqueurs diagnostiques et cibles potentielles de médicaments dans le cancer humain 4.
Cependant,plusieurs défis doivent être surmontés à l'égard de l'analyse protéomique des cancers humains primaires 5. Tout d'abord, des échantillons de cancer humain présentent souvent un degré élevé d'hétérogénéité cellulaire qui est due à la présence de divers types de cellules appartenant au micro-environnement de la tumeur, y compris les cellules immunitaires et les fibroblastes. Deuxièmement, l'évolution clonale conduit à la diversité génétique dans les tumeurs elles-mêmes, ce qui entraîne l'existence de plusieurs sous-populations cellulaires ayant des propriétés fonctionnelles distinctes. Selon le concept actuel de quelques cellules souches du cancer étant les forces motrices derrière le développement du cancer et la progression, analyse protéomique de ces sous-populations cellulaires (fonctionnellement très pertinents) devrait être d'une importance majeure pour une meilleure compréhension des mécanismes oncogéniques pertinentes pour l'application clinique 6. En troisième lieu, les profils d'expression de protéines quantitatives de grandes séries d'échantillons sont souvent nécessaires pour l'identification du solide clinique BiomarKERS; cela ne peut être accompli par l'étiquetage des produits chimiques tels que iTRAQ 7, tandis que les stratégies de marquage métabolique – se appuyant, comme ils le font, sur la prolifération cellulaire 4 – sont également inapplicable. En quatrième lieu, la plupart des échantillons de tumeurs solides disponibles sont fixés à la formaline, ce qui complique l'analyse spectrométrique de masse du protéome due à la formation de reticulations de protéines 8. Enfin, la plupart des workflows existants protéomique nécessitent des quantités importantes de traitement des échantillons et d'acquisition de données, ce qui rend l'analyse des numéros d'échantillons pertinents pour la recherche clinique difficile, et appelant à nouveau workflow paradigmes de 9,10.
Pour surmonter ces obstacles, nous avons développé un dispositif expérimental qui combine soit cellule de cytométrie en flux de tri 11 ou laser capture microdissection 12,13 pour l'enrichissement cellulaire avec une stratégie Super-SILAC 14 d'introduire une norme globale interne pour l'analyse par spectrométrie de masse globale. En utilisant le procédé décrit ici, il est possible de quantifier jusqu'à 8000 protéines dans des échantillons de tumeurs humaines simples dérivées de cancers solides ou liquides.
Spectrométrie de masse profilage des protéomes des cellules cancéreuses provenant de patients est nécessaire pour la découverte de nouveaux biomarqueurs de diagnostic / prédictifs ainsi que de donner une meilleure compréhension de la biologie des cellules cancéreuses, ce qui pourrait à son tour conduire à l'identification de nouvelles cibles potentielles de médicaments. Cependant, ces analyses spectrométrie de masse sont très difficile, notamment en raison de diverses questions pré-analytiques doivent être résolus, si l'on veut obtenir des résultats robustes et biologiquement pertinents.
Le flux de travail expérimental décrit ici permet la caractérisation protéomique quantitative des protéomes sous-populations cellulaires dérivées de tumeurs à la fois liquides et solides. L'enrichissement initial des cellules tumorales, soit par FACS sur la base de cellule de microdissection sortingor est nécessaire pour éviter la contamination par des cellules du micro-environnement de la tumeur. En outre, ces techniques permettent d'isoler les sous-populations cellulaires d'intérêt. Études de cellules biologiques récentes ont démontré que certaines sous-populations cellulaires ont des propriétés initiatrices de tumeurs et sont donc très pertinent pour la pathogenèse du cancer 19,20. Comme la spectrométrie de masse est devenue plus sensible au cours des dernières années, des analyses quantitatives protéomiques sont réalisables pour les petites quantités de protéines qui peuvent être tirés de quelques milliers de cellules, ce qui permet de se concentrer sur des populations de cellules fonctionnellement pertinents.
Le set-up présenté ici peut être utilisé pour identifier et valider de nouveaux biomarqueurs de diagnostic dans des échantillons FFPE. Par conséquent, il promet à Bea outil utile pour l'amélioration des diagnostics cliniques, à ce jour, il ya encore un manque de biomarqueurs moléculaires en nombre et en qualité suffisante pour de nombreux types de cancer. Des exemples importants de diagnostics différentiels difficiles, pour lesquels biomarqueurs font défaut, sont la discrimination entre cancer du poumon primaire à partir de métastases dans le poumon, le carcinome cholangiocellulaires intrapancréatique et adénocarcinome pancréatique, ainsi que diffèrentciation du neurofibrome bénigne de tumeurs malignes périphériques très nerveux gaine. En outre, nous et d'autres avons montré que l'élucidation quantitative des signatures protéomiques peut être utile dans l'étude de biologie des cellules cancéreuses en général, et pour révéler biomarqueurs prédictifs de la réponse thérapeutique chez les patients cancéreux 21.
Deux inconvénients actuels de la méthode présentée ici sont l'exigence d'une vaste traitement manuel de l'échantillon et la demande sur le nanoLC-MS / MS temps d'acquisition. Alors que le premier peut être adressée en déplaçant la préparation des échantillons à par exemple, les formats de 96 puits et en utilisant un traitement robotique, ce dernier exigera un changement dans la stratégie d'acquisition de spectrométrie de masse. Une fois que les sous-ensembles de protéines cibles ont été identifiés qui peuvent être associées avec, par exemple, la classification de la tumeur, nous envisageons la conception des procédés de spectrométrie de masse ciblés qui fournissent des lectures quantitatives pour ces sous-ensembles avec un effort de séparation fortement réduite, etdonc avec un temps d'acquisition réduit en conséquence. Si le temps d'acquisition requis requis pourrait être réduit de 24 à 36 h (tumeurs liquides) ou 3 heures (tumeurs solides) pour, par exemple, 1 heure par spectrométrie de masse et un simple séparation unidimensionnelle de peptides, le gain résultant du débit ciblé pourrait être utilisé pour augmenter de manière significative le nombre de répétitions biologiques et techniques examinés, avec des améliorations correspondantes dans la signification des résultats de quantification. Approches de spectrométrie de masse ciblées ont déjà été démontré être un outil approprié pour la vérification de cancer associé protéines biomarqueurs candidats-22, et ont été développés à un point où ils sont prometteurs pour la validation ou même comme un outil potentiel pour une utilisation clinique de routine 23 , 24.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia Münch for technical support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
660 nm Kit | Thermo scientific | 22662 | |
Cell culture medium depleted of arginine and lysine | Thermo Scientific | 88421 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution | Bio Rad | 161-0436 | |
Dialyzed fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-107 | |
Diffuser caps for microdissection | MMI | 50202 | |
FACS-sorter | BD | FACSAria III | |
Ionic Detergent Compatibility Reagent | Thermo scientific | 22663 | |
Laser-capture microdissector | MMI | cell cut plus | |
LDS buffer | Life Technologies | NP0009 | |
Membrane slides for microdissection | MMI | 50103 | |
Microcon YM-30 | Millipore | MRCF0R030 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels | Life Technologies | NP0335PK2 | |
Picofrit Self-Pack Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | Mass Spectrometry Column/Emitter |
Reducing agent | Life Technologies | NP0007 | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 3 µm | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 5 µm | |
SILAC-labeled arginine | Eurisotop | CLM-2265-H-0.1 | |
SILAC-labeled lysine | Eurisotop | DLM-2640-0.25 | |
Trypsin, NB Sequencing Grade | Serva | 3728301 | for in-gel digests |
Trypsin, Sequencing Grade | Promega | V5111 | for in-solution digests |
Buffer and solutions | |||
Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF, 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4 | |||
Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT | |||
Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
0.05 M NH4HCO3 | |||
10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
5% aqueous formic acid. |