Kinesins worden gekenmerkt door nucleotide-afhankelijke interactie met microtubuli: een cyclus van ATP omzet gekoppeld met een cyclus van microtubule interactie. We beschrijven hier protocollen om de kinetiek van afzonderlijke nucleotide overgangen in de ATP omzet cyclus van een kinesine met fluorescent gemerkte nucleotiden en gestopte stroming fluorescentie geanalyseerd.
De kinesine superfamilie van microtubuli geassocieerde motorische eiwitten delen een karakteristieke motor domein dat zowel hydrolyseert ATP en bindt microtubuli. Kinesins weer verschillen tussen de superfamilie zowel in ATP omzet en in microtubuli interactie. Deze verschillen op maat specifieke kinesins om diverse functies zoals vrachtvervoer, microtubuli schuiven, microtubuli depolymerisatie en microtubuli stabilisatie. Om het werkingsmechanisme van een kinesine begrijpen is het belangrijk te begrijpen hoe de chemische cyclus van ATP omzet is gekoppeld met de mechanische cyclus van microtubuli interactie. De ATP omzet cyclus ontleden, een benadering om fluorescent gemerkte nucleotiden gebruiken om afzonderlijke stappen in de cyclus visualiseren. Het bepalen van de kinetiek van elk nucleotide overgang in de ATP omzet cyclus kan de snelheidsbeperkende stap of stappen voor de gehele cyclus te identificeren. Voor een kinesine, is het belangrijk om de snelheidsbeperkende stap kennen, inAangezien microtubules, zoals deze stap wordt gewoonlijk versneld duizenden voudig indien de kinesine interageert met microtubules. De cyclus in afwezigheid van microtubuli wordt vergeleken met die in de aanwezigheid van microtubuli volledig begrijpen kinesine ATP omzet cyclus. De kinetiek van afzonderlijke nucleotide overgangen doorgaans te snel waarnemen handmatig mengen reagentia, met name in aanwezigheid van microtubules. Een snelle menginrichting, zoals een gestopte stroming fluorimeter, waardoor kinetiek worden waargenomen op tijdschalen van slechts enkele milliseconden, kan worden gebruikt om dergelijke overgangen te controleren. We beschrijven hier protocollen waarin snelle menging van reagentia gestopte stroming wordt gebruikt in combinatie met fluorescent gemerkte nucleotiden ATP omzet cyclus van kinesine ontleden.
De kinesins zijn een superfamilie van eiwitten gekenmerkt door een zeer geconserveerd domein motor 1. De kinesine motor domein interageert met microtubuli in een nucleotide-afhankelijke wijze. Leden van de kinesine familie te tonen een scala aan functies uit translocerende kinesins, die lading in een gerichte manier langs microtubuli, aan niet-translocerende microtubuli-end binding kinesins, die microtubuli dynamiek 2,3 reguleren.
Kinesins gebruik maken van de omzet van adensosine-5'-trifosfaat (ATP) om hun interactie met de microtubuli cytoskelet 4-6 reguleren. De conformatie van het kinesine motor domein en daardoor de affiniteit voor het microtubule afhankelijk van de nucleotide toestand: ATP, ADP kan, ADP.Pi of geen nucleotide gebonden (figuur 1). Naar het moleculaire mechanisme van een kinesine begrijpen, is een goed begrip van de relatie tussen ATP omzet en microtubuli interactie vereist. Hetor wij, een hoofddoel van het veld kinesine betreft de functionele eigenschappen van verschillende nucleotide staten en de kinetiek van de overgangen tussen twee in de aanwezigheid en afwezigheid van microtubuli karakteriseren.
Figuur 1 De eenvoudigste ATP omzet cyclus een kinesine bestaat uit vier mogelijke toestanden: nucleotide-free (Φ), ATP-gebonden, ADP.P i -gebonden en ADP-gebonden Elk van de vier transities gekenmerkt door een voorwaartse en. achteruit snelheidsconstante (k x respectievelijk k -x).
Om te begrijpen hoe de chemische cyclus van ATP omzet is gekoppeld met de mechanische cyclus van microtubuli interactie moet een die stap in de ATP omzet cyclus bepalen is snelheidsbepalend bij afwezigheid van microtubules en bepalen hoe de cyclus wordt veranderd door de aanwezigheid van microtubules. De eenvoudigste ATP omzet cyclus bestaat uit vier afzonderlijke chemische stappen: (1) ATP binding aan de lege plaats (Φ geeft de lege plaats, dat wil zeggen, nucleotide-free kinesine); (2) ATP splitsing; (3) fosfaat dissociatie en (4) ADP dissociatie (figuur 1). De snelheidsbeperkende stap stelt de snelheidsconstante voor de volledige ATP omzet cyclus. Derhalve, om te bepalen welke stap is snelheidsbepalend elk van de afzonderlijke overgangen worden gemeten en vergeleken met de snelheidsconstante voor de gehele cyclus. Methoden om de totale ATP omzet cyclus constant worden hier niet beschreven te meten maar kan worden gevonden referentie 7 Hier beschrijven we methoden waarmee rate constanten voor de afzonderlijke chemische stappen kan worden bepaald. Er zijn verschillende methoden om individuele overgangen bestuderen in de omzet cyclus van een nucleotide hydrolyseren eiwit. De hier gepresenteerde methoden nemen advantage van de eigenschappen van nucleotiden gemerkt met de fluorofoor methylanthraniloyl, meestal aangeduid als mant, die een verandering in fluorescentie-intensiteit weer bij binding aan eiwit 8. De mant wordt gebruikt, omdat het kleine formaat betekent dat, indien gekoppeld aan de ribose (figuur 2A), moet gewoonlijk weinig of geen effect op de kinetiek van nucleotide binding of hydrolyse 9-12. Hier presenteren we protocollen die het gebruik van gemerkte nucleotiden-mant, samen met gestopte stroming fluorescentie, observatie van nucleotide binding en dissociatie mogelijk in de ATP omzet cyclus van kinesine.
Hier presenteren we protocollen voor observatie en analyse van de kinetiek van de overgangen tussen nucleotide staten voor een kinesine. Deze protocollen maken gebruik van de snelle menging werkwijze gestopte stroming in combinatie met fluorescent gelabelde nucleotiden. Werkwijzen van dit type zijn uitgebreid gebruikt nucleotide binding en dissociatie van diverse kinesins 9-11,13-16 studeren. De beschreven hebben waarneming van fosfaat afgifte (Figuur 1, stap 3) niet toe methoden. Echter, gestopte stroming fluorescentie gebruikt om deze overgang zien met een fosfaat sensing eiwit te koppelen van de productie van fosfaat een fluorescentie-intensiteit verandering 17. De werkwijzen voorgesteld gebruik nucleotiden gelabeld met de kleine fluorofoor methylanthraniloyl (mant), die in het algemeen vertonen een toename in fluorescentie-intensiteit wanneer gebonden aan eiwit. Bovendien mant fluorofoor, wanneer geconjugeerd aan ofwel de 2 'of 3' positie op de ribose, heeft vaak weinig of geen effect op de binding, dissociatie of hydrolyse van de nucleotide 9-12. Mant-gemerkte nucleotiden zijn verkrijgbaar bij commerciële bronnen (zie materialen) en worden als mengsels van de 2 'en 3' conjugaat ze snel opnieuw in evenwicht wanneer gezuiverd tot een enkel isomeer 8. -Mant gemerkte nucleotiden maken uitstekende reporter moleculen waarbij de kinetiek van nucleotide binding en dissociatie kan worden waargenomen.
Het gebruik van fluorescent gemerkte nucleotiden betekent dat het uitlezen van de beschreven assays is een realtime verandering in fluorescentie-intensiteit. Dit maakt deze assays geschikt voor gestopte stroming fluorescentie, die snelle menging van de reagentia en real time waargenomen veranderingen in fluorescentie geassocieerd met de daaropvolgende reactie mogelijk maakt. De combinatie van gestopte stroming als de mengtechniek en fluorescentie als detectiemethode vormt een systeem dat relatief sample efdoende. Om bijvoorbeeld de in figuur 3C gegevens door nodig 0,8-1,0 mg gezuiverd kinesine-13, MCAK, en de in figuur 4B gegevens door nodig ~ 0,3 mg gezuiverd kinesine-13, MCAK. Een nadeel van het gebruik van mant als een fluorofoor is dat het gevoelig voor fotobleken. Dit kan worden waargenomen los van kinesine reactiekinetiek door een oplossing van gemerkt nucleotide-mant met reactiebuffer, in afwezigheid van kinesine, in de gestopte stroming. Een langzame afname in fluorescentie-intensiteit waargenomen als de mant groep wordt gebleekt. Over het bereik van termijnen in de beschreven fotobleken van de mant groep protocollen wordt goed beschreven door een lineaire functie. Daarom is een eenvoudige manier de gegevens voor fotobleken correct past een exponentiële functie met een uitgangswaarde beschreven door een lineaire functie (dwz mt + c) in plaats van de gebruikelijke vlakke basislijn, beschreven door een enkele parameter.
<p class = "jove_content"> mantATP bindendBij het meten van snelheidsconstanten van associatie en dissociatie van mantATP (deel 2) de ADP, dat geassocieerd blijft met het kinesine-nucleotide bindingsplaats in afwezigheid van microtubuli, worden verwijderd. Dit maakt mantATP vereniging en dissociatie (Figuur 1, stap 1) in acht worden genomen los van ADP dissociatie. Om dit te bereiken de kinesine wordt geïncubeerd met tenminste een 50-voudige overmaat van EDTA op nucleotide bindingsplaatsen (Stap 2.1). De EDTA sequesters Mg2 +-ionen veroorzaken Mg2 + dissociëren van de nucleotide-bindende pocket, waardoor afgifte van de nucleotide 11. Daarom, bij het uitvoeren van de stappen 2,1-2,3, is het essentieel om een buffer vrij van Mg 2 + gebruiken. De nucleotide-free kinesine eiwit buffer uitgewisseld te scheiden zowel vrij nucleotide en van EDTA. Om deze scheiding, een wegwerp zwaartekracht-stroom ge volbrengenl filtratie kolom is voldoende en is eenvoudig en snel te gebruiken (zie de lijst van materialen). De interactie van mantATP met nucleotide gratis kinesine wordt uitgevoerd bij een reeks mantATP concentraties (Stap 2.4) uitgevoerd om deconvolutie van de vereniging en dissociatiesnelheidsconstanten (Stap 2.8) in te schakelen. De theorie achter de experimenten van dit type wordt ook beschreven in referentie 18 Bij het uitvoeren van deze experimenten men begint met de laagste concentratie mantATP. Dit neemt de noodzaak voor wasstappen tussen de verschillende concentraties. Het zal waarschijnlijk nodig zijn om de gevoeligheid van de gestopte stroming fluorimeter aanpast wanneer de mantATP concentratie wordt verhoogd. De mantATP concentratie moet altijd minstens 5-voudige overmaat ten opzichte van de concentratie van kinesine nucleotide bindingsplaatsen aan pseudo eerste orde te handhaven. Aangezien de concentratie van mantATP toeneemt, de signaalverandering kan raken overspoeld als de fractie van nucleotide dat bindt aan afneemt kinesine. Therefore, wordt de concentratie van het kinesine ook verhoogd voor elke concentratie mantATP zodat de concentratie van mantATP nooit groter dan 10-voudige molaire overmaat ten opzichte van nucleotide bindingsplaatsen (Stap 2.6).
mantADP Dissociatie
Hoewel associatie en dissociatie snelheidsconstanten voor mantADP kan worden bepaald volgens dezelfde methode beschreven voor mantATP (deel 2). Dissociatie van ADP van een kinesine kan direct worden waargenomen door preloading de nucleotide-bindingsplaats met mantADP (stappen 3.1-3.3) De mantADP.kinesin complex wordt vervolgens gemengd met een overmaat ongelabeld ATP (stap 3.5). De overmaat ongelabelde ATP voorkomt opnieuw inbinden van mantADP aan de kinesine en daardoor kan de dissociatie reactie (Figuur 1, k 4) in acht te nemen, los van vereniging van mantADP. In deze test moet de concentratie ongemerkt ATP tenminste een 50-voudige molaire overmaat nuc zijnleotide bindingsplaatsen. De theorie achter deze assay wordt goed beschreven in referentie 18 Deze directe methode geeft een nauwkeuriger waarde voor de dissociatiesnelheidsconstante dan de extrapolatie naar de y-as in stap 2.8 beschreven.
Opname van microtubuli
De beschreven werkwijzen kunnen ook worden gebruikt om de kinetiek van nucleotide binding en dissociatie bepaald in aanwezigheid van microtubules. Microtubuli kennis met de nucleotide met spuit voor het mengen in de gestopte stroming: de onderste spuit in figuur 3B en 4B (Inlegwerk). In deze configuratie zal de kinesine de nucleotide aan op hetzelfde moment als het voldoet aan de microtubules. Gestabiliseerde microtubuli worden gebruikt, waarbij de levensduur van de tubuline polymeer wordt verlengd door het gebruik van ofwel een stabilisatie chemische, zoals taxol of een nonhydrolysable GTP analoog, zoals guanosine-5 '- [(α, β) -methyleno] trifosfaat (GMPCPP, zie lijst van materialen). Het is mogelijk om twee cycli van tubuline polymerisatie met GMPCPP om microtubuli die kan worden opgeslagen gedurende vele maanden in vloeibare stikstof 9,19 maken. Het gebruik van vooraf bereide microtubuli vermindert significant de praktische problemen bij het uitvoeren van deze testen. Om microtubuli in de assays omvatten, is het belangrijk om een reactie buffer geschikt voor microtubule stabiliteit te gebruiken. De buffer van keuze is gebaseerd PIPES, de meest gebruikte buffer die 80 mM PIPES pH 6,9, 1 mM MgCl2 en 1 mM EGTA (zogenaamde BRB80) 20,21.
De beschreven werkwijzen zijn niet beperkt tot gebruik met kinesins, maar kan worden aangepast en toegepast op elke nucleotide bindend eiwit. Zo zijn soortgelijke werkwijzen toegepast op de ATP omzet cyclus van leden van de familie van myosine moleculaire motoren 12,22 en het gebruik van mant gemerkte guanosine nucleotiden breidtmethoden van dit type GTP hydrolyse van eiwitten 23,24.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door de Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC), de Royal Society en de Universiteit van Nottingham.
Name of Material/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments/Description |
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate | Jena Biosciences | # NU-202 | mantATP |
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate | Jena Biosciences | # NU-201 | mantADP |
Mg-ATP | Roche | # 10519979001 | The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC. |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120-500 | 0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled. |
Dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | 1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin. |
NAP-5 column | GE Healthcare | # 17-0853 | G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column |
GMPCPP | Jena Biosciences | # NU-405 | nonhydrolysable analogue of GTP |
Stopped-flow fluorimeter | Applied Photophysics | SX20 | A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 s to be monitored. |