형광 흐름 중지 및 레이블 뉴클레오티드의 사용은 키네신의 ATP 턴 오버주기를 분석하는
Summary
키네신은 미세 소관과 염기에 의존하는 상호 작용에 의해 특징 : 미세 소관의 상호 작용의주기에 결합 ATP 매출의주기를. 여기서는 형광 표지 뉴클레오티드 및 정지 흐름 형광을 사용 키네신의 ATP 턴 오버주기 개별 뉴클레오티드 천이 동력학을 분석하는 프로토콜을 기술한다.
Abstract
미세 소관 관련 모터 단백질의 키네신 상과는 모두 ATP를 가수 분해하고 미세 소관을 결합하는 특성 모터 도메인을 공유 할 수 있습니다. 키네신은 ATP 매출 및 미세 소관의 상호 작용의 두 거대 집단에서 차이를 표시합니다. 이러한 차이는화물 운송, 미세 소관 슬라이딩, 미세 소관 해중합 및 미세 소관 안정화 등 다양한 기능을 특정 키네신을 조정. 키네신의 작용 기전을 이해하기 위하여는 ATP 회전율의 화학 사이클은 미세 소관의 기계적 상호 작용 사이클에 연결되는 방법을 이해하는 것이 중요하다. ATP 턴 오버주기를 해부, 하나의 접근 방식은주기의 각 단계를 시각화하는 형광 표지 뉴클레오티드를 이용하는 것이다. ATP 회전율주기의 각 염기 전환의 반응 속도를 결정하는 것은 완전한 사이클을 식별 할 수에 대한 속도 제한 단계 또는 단계를 할 수 있습니다. 키네신, 그것은에서 속도 – 제한 단계를 아는 것이 중요키네신은 미세 소관과 함께 상호 작용할 때 미세 소관의 부재는,이 단계는 일반적으로 수천 배로 촉진되어있다. 미세 소관의 부재주기를 완전히 키네신의 ATP 회전율 사이클을 이해하는 미세 소관의 존재 하에서 그와 비교된다. 개별 뉴클레오티드 천이 속도론은 일반적으로 수동 특히 미세 소관의 존재 하에서 반응물을 혼합하여 관찰 너무 빠르다. 급속한 혼합 장치는, 예컨대 동역학은 수 밀리 초만큼 약간의 시간 척도에서 관찰 될 수 있도록 정지 흐름 fluorimeter으로, 그러한 천이를 감시하는데 사용될 수있다. 여기서는 정지 흐름에 의한 시약의 급속 혼합은 키네신의 ATP 턴 오버주기를 해부 형광 표지 뉴클레오티드와 함께 사용되는 프로토콜을 기술한다.
Introduction
키네신은 고도로 보존 된 모터 도메인 한 것을 특징으로하는 단백질의 슈퍼 패밀리이다. 키네신 모터 도메인은 뉴클레오티드 의존적으로 미세 소관과 상호 작용한다. 키네신 가족의 구성원은 미세 소관 역학 2,3를 조절 비 전좌 미세 소관 최종 바인딩 키네신에 미세 소관을 따라 감독 방식으로화물을 운반 전좌 키네신,,,에서 기능의 범위를 표시합니다.
키네신은 4-6 세포 골격 미세 소관 (microtubule)과의 상호 작용을 조절하는 adensosine-5'-삼인산 (ATP)의 매출을 사용합니다. ATP, ADP, ADP.Pi 또는 전혀 염기가 결합 될 수있다 (그림 1) : 미세 소관의 키네신 모터 도메인 때문에 친화력의 형태는 염기 상태에 따라 다릅니다. 키네신의 분자 적 메커니즘을 이해하기 위해, ATP 회전율 미세 소관과 상호 관계의 이해가 필요하다.refore은 키네신 필드의 주요 목적은 상이한 뉴클레오티드 상태의 기능적 특성 및 미세 소관의 존재 및 부재하에 둘 사이에 전환 동력학을 특성화하는 것이다.
키네신에 대한 간단한 ATP 턴 오버주기 그림 1은 네 가지 상태로 구성됩니다. 염기가없는 (Φ) 사 전환의 각각은 순방향 및 특징, ADP.P 내가 -bound, ATP가 바인딩과 ADP가 결합 된 역방향 속도 상수 (K x 및 각각 -x K).
ATP 회전율의 화학 사이클 미세 소관의 기계적 상호 작용 사이클에 결합되는 방법을 이해하기 위해서는, 하나의 레이트 microtub 부재 제한 ATP 회전율주기의 어느 단계를 결정해야한다개 모듈은 다음 사이클이 미세 소관의 존재에 의해 변경되는 방식을 결정합니다. 가장 간단한 ATP 턴 오버주기는 네 개별 화학 물질 단계로 구성 : (1) ATP가 빈 사이트에 바인딩 (Φ가 빈 사이트, 즉 염기없는 키네신을 의미한다); (2) ATP 분열; (3) 인산의 해리 및 (4) ADP 해리 (도 1). 속도 제한 단계는 완전한 사이클 ATP 턴 오버에 대한 속도 상수를 설정한다. 따라서, 각각의 천이 각각 측정하고 완전한 사이클에 대한 속도 상수에 비교해야 속도 제한이있는 단계를 결정한다. 방법은 여기서 설명되지 않은 전반적 ATP 회전율 사이클 속도 상수를 측정 할 수 있지만 여기에 참고 7에서 발견 될 수 있고, 우리는 각각의 단계에 대한 화학적 반응 속도 상수를 판별 할 수있는 방법을 설명한다. 염기 가수 분해 단백질의 정점에서 개개의 전환주기를 연구하는 데 사용할 다수의 방법이있다. 여기에 제시된 방법은 advantag을형광 물질로 표지 된 methylanthraniloyl 뉴클레오티드의 특성 예는, 일반적으로 단백질 (8)에 결합시 형광 강도의 변화를 표시 mant, 라. 그것의 작은 크기는 리보오스 (도 2A)에 결합 될 때, 그것은 일반적으로 뉴클레오티드 결합 또는 9-12의 가수 분해 반응 속도에 거의 또는 전혀 효과를 가지고 있음을 의미하기 때문 mant 그룹이 사용된다. 여기서는 키네신의 ATP 턴 오버주기 뉴클레오티드 결합 및 분리의 관찰을 할 수 있도록 정지 흐름과 결합해서 형광 mant-표지 된 뉴클레오티드의 사용을 기술하는 프로토콜을 제시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에, 우리는 키네신에 대한 염기 상태 사이의 전환 역학의 관찰 및 분석을위한 프로토콜을 제시한다. 이러한 프로토콜은 형광 표지 뉴클레오티드와 함께 급속 혼합 방법 정지 흐름을 이용한다. 이 유형의 방법은 키네신 9-11,13-16의 다양한 뉴클레오티드가 결합 및 해리 공부 광범위하게 사용되어왔다. 인산 릴리스 (그림 1, 3 단계)의 관찰을 허용하지 설명하는 방법. 그러나, 정지 흐름 형광은 형광 강도의 변화 (17)에 결합하도록 인산염의 인산염 생산을 감지 단백질을 이용하여 이러한 전환을 관찰하기 위해 사용될 수있다. 단백질에 결합 할 때, 일반적으로 형광 강도의 증가를 나타내는 작은 형광 단 methylanthraniloyl (mant)로 표지 뉴클레오티드를 이용 제시 방법. 또한, mant의 형광체는, 경우에 R 2 '또는 3'위치 중 하나에 접합ibose 종종 염기 9-12의 결합, 분해 또는 가수 분해에 거의 또는 전혀 효과가 있습니다. Mant 표지 뉴클레오티드는 상업 소스 (재료의 목록 참조)에서 쉽게 사용할 수있는 단일 이성질체 8 정제 할 때 빠르게 다시 평형으로 2 '및 3'복합체의 혼합물로 제공됩니다. Mant 표지 뉴클레오티드는 염기 결합과 분해의 반응 속도를 관찰 할 수있는 훌륭한 기자 분자를 확인합니다.
형광 표지 된 뉴클레오티드의 사용은 기재된 분석에서 형광 강도의 실시간 변경을 판독한다는 것을 의미한다. 이는 시약의 신속한 혼합과 후속 반응과 관련된 형광의 변화를 실시간 관찰을 허용 정지 흐름 형광, 이러한 분석에 적합하다. 검출의 방법으로서 혼합 기술과 같은 형광 정지 흐름의 조합이 상대적으로 샘플 EF 인 시스템을 생산ficient. 예를 들어, 0.8 필요도 3c에 도시 된 데이터를 획득하기 위해 – 정제 키네신-13 1.0 mg의, MCAK는,도 4b에 도시 된 데이터를 획득하는 것은 ~ 정제 키네신-13, MCAK 0.3 밀리그램을 필요로한다. 형광 물질로서 mant의 사용의 한 가지 단점은 photobleaching에 경향이 있다는 것이다. 이것은 정지 흐름에서, 키네신의 부재 하에서, 반응 완충액 mant 표지 된 뉴클레오티드의 용액을 혼합하여, 반응 동력학을 키네신 분리하여 관찰 될 수있다. mant 그룹이 표백 된대로 형광 강도의 느린 감소는 관찰된다. mant 그룹의 광표백을 설명한 프로토콜에 사용되는 시간의 척도의 범위에서 잘 선형 함수에 의해 설명된다. 따라서, 광표백에 대한 데이터를 보정하는 방법은 단순한 하나의 파라미터에 의해 설명 된 선형 함수 (즉, MT + c)가 아닌 일반적인 평평한 기준선에 의해 설명 기준선 지수 함수로 적합 할 것이다.
<p cl엉덩이 = "jove_content"> mantATP 바인딩mantATP 협회와 해리에 대한 속도 상수 미세 소관의 부재에서 키네신 뉴클레오티드 바인딩 사이트와 연결된 상태를 유지 (2 절) ADP를 측정 할 때 제거해야합니다. 이 mantATP 협회와 해리 (그림 1, 1 단계) ADP 해리 분리하여 관찰 할 수 있습니다. 이 키네신은 뉴클레오티드 결합 부위 (단계 2.1)를 통해 EDTA의 적어도 50 배 과량 인큐베이션 달성했다. EDTA는 마그네슘 2 + 이온은 염기 (11)의 방출을 초래 염기 결합 주머니에서 해리의 Mg 2 +를 일으키는 원인이 담즙산. 수행은 2.1 단계 때 따라서, – 2.3, 그것은 2 +의 Mg 무료 버퍼를 사용하는 것이 매우 중요합니다. 염기가없는 키네신 단백질은 버퍼가 무료 염기로부터 EDTA에서 모두를 분리하는 교환이다. 이 분리, 일회용 중력 흐름 GE를 달성하기리터의 여과 열은 충분하며, 간단하고 (물질의 목록 참조)를 사용하는 것이 빠르다. 자유 염기와 mantATP 키네신의 상호 작용과 연관 해리 속도 상수 (단계 2.8)의 컨벌루션 있도록 mantATP 농도 (단계 2.4)의 범위에서 수행된다. 이러한 유형의 실험 뒤에 이론은 잘 하나 mantATP의 낮은 농도로 시작이 실험을 수행하는 참고 문헌 18에 기재되어있다. 이것은 다른 농도 사이의 세척 단계의 필요성을 제거합니다. 그것은 가능성 mantATP 농도가 증가함에 따라 중지 흐름 fluorimeter의 감도를 조정하는 것이 필요하다. mantATP 농도는 항상 의사 일차 조건을 유지하기 키네신 뉴클레오티드 결합 부위의 농도에서 최소한 5 배를 초과해야한다. mantATP의 농도가 증가함에 그러나, 신호 변화가 감소 키네신에 결합 뉴클레오티드의 분수로 일손이 될 수있다. Therefo, 키네신의 농도는 각각의 새로운 mantATP 농도 증가 mantATP 재 등의 농도는 뉴클레오티드 결합 부위 (단계 2.6) 이상으로 10 배 몰 과량보다 결코 크다고.
mantADP 해리
mantADP 협회 및 해리 속도 상수는 mantATP (섹션 2)에서 기술 한 바와 동일한 방법에 의해 측정 될 수 있지만. 키네신로부터 ADP의 해리 직접 mantADP.kinesin 착체이어서 비 표지 ATP (단계 3.5)의 과량 혼합 mantADP (단계 3.1-3.3)와 뉴클레오티드 결합 부위를 미리로드에 의해 관찰 될 수있다. 초과 레이블이없는 ATP는 키네신에 mantADP의 리 바인딩을 방지함으로써 mantADP 협회에서 분리에서 관찰 할 수있는 해리 반응 (그림 1, K 사)를 할 수 있습니다. 이 분석에서, 비 표지 ATP의 농도는 NUC의 적어도 50 배 몰 과량이어야결합 부위를 leotide. 이 분석 배후 이론은 잘 이러한 직접적인 방법은 단계 2.8에서 설명 된 Y-축에 외삽 상수보다 해리 속도에 대한 정확한 값을 제공 레퍼런스 18에서 설명된다.
미세 소관의 포함
설명 된 방법은 또한 미세 소관의 존재하에 염기의 결합 및 해리 동력학을 결정하는데 사용될 수있다. 미세 소관 전에 중지 흐름에 혼합에 염기가 포함 주사기 소개 : 그림 (b)와 (b)에서 낮은 주사기 (인 세트). 이 미세 소관을 만족시키는이 구성에서, 키네신은 동시에 뉴클레오티드를 만날 것이다. 안정화 된 미세 소관은 튜 불린 중합체의 수명은 안정화 화학, 하나의 사용에 의해 확장되는 경우, 사용되는 예컨대 '구아노 신-5와 같은 탁솔 또는 nonhydrolysable GTP 유사체뿐만 – [(α, β) -methyleno] 삼인산 (GMPCPP는 물질의 목록 참조). 이는 액체 질소 9,19에서 수개월 동안 저장 될 수 있도록 미세 소관 GMPCPP와 튜 불린 중합의 2 사이클을 사용하는 것이 가능하다. 미리 제조 된 미세 소관의 사용은 상당히 이러한 분석을 수행하기에 실용적 어려움을 감소시킨다. 분석에서 미세 소관을 포함하기 위해, 미세 소관 안정에 적합한 반응 완충액을 사용하는 것이 중요하다. 선택의 버퍼 (BRB80라고도 함) 80 mM의 PIPES의 pH를 6.9, 1 mM의 MgCl2를 1 mM의 EGTA (20, 21)을 포함하는 가장 일반적으로 사용되는 버퍼 기반 PIPES이다.
설명 된 방법은 키네신과 사용이 제한되지 않지만, 구성된 모든 뉴클레오티드 결합 단백질에 적용될 수있다. 예를 들어, 유사한 방법 분자 모터 (12,22)의 미오신 가족 mant 구아노 신 표지 된 뉴클레오티드의 사용의 상기 연장 부재의 ATP 회전율 사이클에 적용된이 유형의 방법은 단백질 23,24 GTP 가수 분해한다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회 (BBSRC), 왕립 학회와 노팅엄 대학에서 지원됩니다.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments/Description |
| 2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate | Jena Biosciences | # NU-202 | mantATP |
| 2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate | Jena Biosciences | # NU-201 | mantADP |
| Mg-ATP | Roche | # 10519979001 | The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120-500 | 0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled. |
| Dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | 1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin. |
| NAP-5 column | GE Healthcare | # 17-0853 | G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column |
| GMPCPP | Jena Biosciences | # NU-405 | nonhydrolysable analogue of GTP |
| Stopped-flow fluorimeter | Applied Photophysics | SX20 | A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 s to be monitored. |
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