Propagación de<em> Homalodisca coagulata virus-01</em> A través de<em> Homalodisca vitripennis</em> Cultivo Celular
Summary
Aquí se presenta un protocolo para propagar células Homalodisca vitripennis y HoCV-1 in vitro. Se retiró el medio de HoCV-1 cultivos positivos y ARN extraído cada 24 h durante 168 horas. Supervivencia celular se cuantificó mediante tinción con azul de tripano. Partículas virales enteras fueron extraídos después de la infección. ARN extraído se cuantificó por QRT-PCR.
Abstract
La chicharrita de alas cristalinas (Homalodisca vitripennis) es un insecto altamente vagile y polífagas encuentra en todo el suroeste de los Estados Unidos. Estos insectos son los vectores predominantes de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), una bacteria xilema limitado que es el agente causal de la enfermedad de Pierce (PD) de la vid. La enfermedad de Pierce es económicamente perjudicial; Por lo tanto, H. vitripennis se han convertido en un objetivo para las estrategias de manejo de patógenos. Un dicistrovirus identificado como Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) se ha asociado con un aumento de la mortalidad en H. poblaciones vitripennis. Debido a que se requiere una célula huésped para la replicación HoCV-01, cultivo celular proporciona un entorno uniforme para la replicación dirigida que es logísticamente y económicamente valiosa para la producción de biopesticida. En este estudio, un sistema para la propagación a gran escala de H. vitripennis células a través de cultivo de tejidos se desarrolló, providing un mecanismo de replicación viral. HoCV-01 se extrajo de insectos de todo el cuerpo y se usa para inocular H. cultivaron vitripennis células en diferentes niveles. El medio de cultivo se eliminó cada 24 h durante 168 h, ARN extraído y analizado con QRT-PCR. Las células se tiñeron con azul de tripano y se contaron para cuantificar la supervivencia celular usando microscopía de luz. Partículas de virus enteros se extrajeron hasta 96 h después de la infección, que fue el punto de tiempo determinado que antes de producirse el colapso total de cultivo celular. Las células también se sometieron a tinción fluorescente y vistos usando microscopía confocal para investigar la actividad viral en la F-actina apego y núcleos integridad. La conclusión de este estudio es que el H. vitripennis células son capaces de ser cultivadas y se utiliza para la producción en masa de HoCV-01 a un nivel adecuado para permitir la producción de un bioplaguicida.
Introduction
La chicharrita de alas cristalinas (Homalodisca vitripennis Germar 1821) ha sido identificado como el vector predominante de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), el agente causal de la enfermedad de la vid (PD) de Pierce en América del Norte 1. Gestión de la población de insectos se ha convertido rápidamente en el foco de la investigación para combatir esta devastadora problema para la industria de la viticultura en California y en todo el sur de Estados Unidos. Una de sentido positivo, el virus de ARN monocatenario perteneciente a la familia Dicistroviridae, Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) ha sido identificada en H. salvaje poblaciones vitripennis y demostrado que aumenta la mortalidad en las poblaciones 2-4, al tiempo que reduce la resistencia de los insectos a los insecticidas.
Desarrollo de métodos para efectivamente trasera infectada H. vitripennis hasta la edad adulta en un entorno de laboratorio han sido difíciles porque <em> H. vitripennis tienen diferentes necesidades nutricionales de una etapa específica que requieren una variedad de plantas huésped 5.8. Instalaciones específicas están obligados a H. vivo trasera vitripennis en los Estados Unidos; Por lo tanto, el cultivo de células es más económico y una alternativa viable, así como cada vez más vital para HoCV-01 de detección y la replicación 2,9. Mientras que los métodos básicos para el establecimiento de cultivos de células de H. vitripennis se describen, estos métodos aún no se han utilizado para la producción comercial de agentes de control biológico, tales como virus 2.
El objetivo general de los siguientes procedimientos es producir una alta concentración de HoCV-01 adecuado para la utilización como agente de control biológico. La replicación viral requiere de una célula viva, que es la razón por cultivar con éxito y optimizar H. vitripennis culturas es vital para el progreso de la producción de los niveles rentables de virus.
Protocol
Representative Results
Discussion
El aumento de las preocupaciones en cuanto a la afluencia de especies agrícolas invasivas han llevado a una mayor demanda de nuevas metodologías para la defensa frente a plagas y patógenos emergentes. Un enfoque de la prevención y manejo de la enfermedad consiste en la gestión de vectores de patógenos y era el objetivo principal de este estudio. Economía desempeñan un papel vital en la decisión de producir este tipo de bioplaguicida para manejar vectores de patógenos en la agricultura debido a la aplicación p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the Texas Pierce’s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning cell culture flasks | Sigma Aldrich | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Inverted microscope and camera | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049 | 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Sigma Aldrich | M8937 | 48 wells (TC treated with lid) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma Aldrich | CLS431206 | Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 mL |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polyethylene glycol hexadecyl ether |
| Phosphate buffer solution | Sigma Aldrich | P5244 | Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | For electrophoresis |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, for molecular biology, powder |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Reagent grade, crystalline |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Phosphate buffered saline |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Rhodamine red-conjugated phalloidin | Life Technologies | R415 | Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Confocal System | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace’s Insect medium (supplemented, 1X) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ leafhopper medium component |
| L-histidine monohydrate | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 199 (10X) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 1066 (1X) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ leafhopper medium component |
| Hank’s Balanced Salts (1X) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ leafhopper medium component |
| L-Glutamine (100X) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ leafhopper medium component |
| MEM, amino acid mix (50X) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ leafhopper medium component |
| 1 M MgCl solution | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ leafhopper medium component |
| Pen-Strep (w/ Glutamine) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ leafhopper medium component |
| Nystatin | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ leafhopper medium component |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ leafhopper medium component |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ leafhopper medium component |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ leafhopper medium component |
References
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