Summary

단일 셀의 정밀도와의 연결을 공동 문화의 준비

Published: May 20, 2014
doi:

Summary

하나의 신경 세포의 미세 유체의으로 배열 및 생체 적합 물질 코팅의 칩 플라즈마 패턴 물 마스킹을위한 프로토콜을 설명합니다. 고도로 상호 공동 배양은 최소 셀 입력을 사용하여 제조 될 수있다.

Abstract

Campenot 실의 미세 유체 실시 예는 신경 과학 사회에서 큰 관심을 받고있다. 이러한 상호 공동 문화 플랫폼은 감염 및 질병 전파에 발달 및 기능 신경 생물학에 걸쳐, 다양한 질문을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 기존의 시스템은 중요한 세포와 같은 기본 도파민 흑색질, 나선 신경절 및 Drosophilia melanogaster의 뉴런의 낮은 풍부 세포 연구에 대한 불충분 한 입력 (구획 당 수천), 및 높은 처리량 실험에 대한 허무가 필요합니다. 조밀 한 문화는 매우 로컬 두 문화를 상호 몇의 outgrowths (<10 %)과 얽혀있다. (I) 미세 유체 하나의 신경 세포는 방법으로 배열하고, 플라즈마 패터닝 생체 재료의 코팅 REGI을위한 (II) 물 마스킹 방법 :이 논문에서는 간단 미세 패터닝 프로토콜은 이러한 문제를 해결하는 설명되어 있습니다신경을 STER과 구획 사이의 파생물을 촉진합니다. 최소한의 신경 세포 공동 배양은 높은 수준 (> 85 %) intercompartment 연결로 제조 된 단일 셀 정밀도 높은 처리량 신경 생물학 실험에 사용될 수있다.

Introduction

신경 조직은 매우 복잡합니다; 공간적 세포 연락처 및 특히 축삭과 수상 돌기의 outgrowths를 통해 통해 정의 층과 구획 내에서 플라스틱 연결과 함께 주문 이종 세포 혼합물. 새로운 기술은 깊은 통찰력과 질병, 개발, 건강 기능 중심 해명 메커니즘을 얻기 위해 더 많은 실험적인 자유를 부여해야합니다. Campenot 챔버 1,2 그리고 더 최근의 마이크로 제조 실시 예 3,4는 선택적으로 다른 체세포 인구 느려지고 또한 신경 돌기의 outgrowths하는 기능과 네트워크의 연결 공동 배양의 생체 외 제조에 사용될 수있다. 이러한 마이크로 유체 장치는 예를 들어 화학 5,6 또는 레이저 axotomy 6-8, 타우 병증 9, 바이러스 전파 10, 11, 및 축삭 4 mRNA의 현지화 다음 축삭의 변성과 재생을 연구하는 데 사용되었습니다.

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신경 생물학의 범위를 확장하기 위해, 기술 개발은 최소한의 신경 세포의 공동 문화를 준비해야합니다. 이것은 하나의 세포 및 서브 셀룰러 정밀 시스템의 조사를 위해 신경 네트워크의 풀림을 할 수 있습니다. 최소한의 세포 수에 대한 요구 사항은 파킨슨 병, 귀에서 나선형 신경절, 말초 신경 관련된 도파민 흑질 세포를 포함한 희귀 세포 유형을 분석하고, 줄기 세포를 수있는 가능성을 연다. 이 외에도, 휴대 경제는 3RS 사업에 관련이 있습니다. 이러한 미세 유체 플랫폼 대규모 독성 스크린 또는 다른 높은 처리량을 이용하여 동물의 신경 세포가 필요한 데이터 풍부한 일련의 실험은 이제 고려 될 수있다.

본 논문에서는 마이크로 유체 장치의 제조 및 사용을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 현장 biomateri에와 함께 마이크로 유체으로 배열알 패터닝 방법은 최소한의 세포 수를 높게하여 상호 연결을 공동 배양의 등록을 위해 사용될 수있다. 미세 유체으로 배열은 차동 흐름 할인 모형의 미세 트랩 유체 회로 (그림 1의 SEM 이미지와 함께 설명) 내에 위치되어있다 12 ~ 15을 기반으로합니다. 신경 돌기 가지의 채널 입구 – 경로 0 → 1은 미세 구멍의 선형 배열에 신경을 운반 낮은 유체 저항 (R 2> R 1)가 있습니다. 하나의 셀에 의해 트랩의 인원은 로컬 이웃 트랩 이후의 세포를 포집 유선을 전환하는 흐름을 방해한다. 배열 트랩의 전체 점유 과잉 뉴런의 제거 동작의 바이 패스 모드를 생성하기 위하여 사문석 경로 (0 → 2)에 유선을 전환하는 유체 비율 (R 1> R 2)를 전환한다.

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그림 1. 미세 유체 회로. 신경 돌기 가지 채널에 의해 상호 문화 실의 측면에있는 하나의 뉴런으로 배열에 대한 A) 차동 저항 유체 회로,. B, 메 니스 커스 (meniscus) 고정 micropillars와 이중층 구획 된 신경 세포의 공동 문화 배열의 C) SEM 이미지. 이 디자인으로, 삼지창 모양의 신경 세포 트래핑 구조는 신경 돌기의 outgrowths의 fasciculation을 촉진하는 데 사용되었습니다. 그림과 화학의 왕립 학회 (RSC)의 허가를 재현 전설 12. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

평면 기판 상에 마이크로 패턴 신경 네트워크의 제조는 용이 exampl 위해 (달성 될 수있다 우리 그룹에서 ES는, Frimat 등. (16)와 헤이 케 등. 17)을 참조하십시오. 그러나, PDMS 장치 내부와 미세 유체 채널이의 마이크로 미터 크기의 정렬의 요구 사항과 생리 활성 물질의 패턴을 캡슐화하는 주요 기술적 인 도전을 포즈. 3.1 절에 대한 프로토콜에 칩, 또는 현장에서, 생체 적합 물질 패턴의 준비가 표시됩니다. 이러한 패턴은 긴 문화 척도 동안 신경 세포의 등록을 활성화하고 구획 사이의 outgrowths을 촉진합니다. 메 니스 커스 고정 마이크로는 신경이 사이트와 신경 돌기 가지 채널을으로 배열과 소위 물 마스크를 정렬하는 데 사용됩니다. 노출 된 표면은 생체 재료 패턴을 정의하기 위해 분해되는 반면, 물 마스크는, 플라즈마 처리 동안에 접착 분자 코팅을 보호한다. 또한, 프로토콜은 세포 배양과 다양한 공동 문화 구획의 선택적인 치료에 필요한 유체 격리를 위해 제공됩니다.

ve_content "> 프로토콜은 이와 유사하게, 현장 생체 재료의 패턴 증발 및 표면 장력 현상을 이용, 간단합니다. 폴리의 복제 (디메틸 실록산) (PDMS) 미세 유체 장치를 18 일 소프트 리소그래피의 사용자 친화적 인 원리를 활용하도록 설계되어 있습니다 만 저렴한 휴대용 플라즈마 소스를 필요로. 미세 유체 회로는 이러한 동작을 만들기 효과적으로 프로그램 셀 로딩 및 구획 구체적인 치료는 단순히 올바른 하단 포트에 재료를 분배하고 위에서 흡입의 문제. 이러한 방식으로,이 신경 생물 학자에게 제공하기위한 것이다 자신의 실험실에서 미세 유체 장치를 준비하고 사용할 수있는 자유.

Protocol

프로토콜은 신경 과학자를 대상으로하고, 그림 2에 요약되어있다. 따라서 그것은 상업적 또는 기관 시설에 아웃소싱 PDMS 복제에 사용 된 SU-8 마스터의 미세을 추천합니다. 두 레이어 마스크 디자인은 화학 웹 사이트 (12)의 왕립 학회에 부가 정보 (ZIP)로 자유롭게 사용할 수 있습니다. 중요한 사실은, 제 SU-8 층은 2.5-3.0 ㎛의 깊이로 제조하고, 25 ~ 30 ㎛의 깊이까지 제되어야한다. …

Representative Results

물 마스킹 공격은 표면 장력. 공기 – 액체 계면에서의 압력 공차는 곡률 [반경 반비례 비늘 , 미세 유체 차원에서 매우 안정적인 인터페이스를 생성. micropillars 효과적으로 대신 물 마스크 앵커. 워터 마스크 형성은 가열에 의해 증가 된 속도로, 마이크로 유체 포트에서 증발에 의해 구동된다. 낮은 배율 (4X – 10X)에서 열을 사용하여 현?…

Discussion

미세 유체으로 ​​배열 기술은 최소한의 문화 구축을위한 정밀 단일 신경 세포의 처리를 가능하게 최초의 것입니다. 미세 구조와 세포의 패턴을 정렬하는 현장 생체 적합 물질 패터닝 방법에있어서, 강력한 접근 방식과 함께, 이러한 최소한의 문화가 감소 된 지역의 얽힘 높은 intercompartment 연결 수준이. 심플한 디자인 수정이 시각화 및 정량 분석​​을위한 개별 축삭을 분리 잠재?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 SEM 이미징 SU-8 제조 마리아 베커 (ISAS)에 대한 울리히 Marggraf (ISAS)에게 감사의 말씀을 전합니다. 연구는 재정적으로 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), Bundesministerium FÜR Bildung 싶게 Forschung 부여 (BMBF 0101-31P6541)에 의해 Ministerium FÜR 혁신, Wissenschaft 싶게 Forschung 데 Landes의 노르 트라 인베스트 팔렌에 의해 지원되었다. 헤이 케 Hardelauf 덕분에 국제 라이프니츠 대학원 "시스템 생물학 연구소 – 온 – 칩"재정 지원에 대한.

Materials

PDMS Sylgard 184 Dow Corning
PDMS Elastosil RT 601 Wacker
Coverslips VWR 630-1590 130-160 mm thick
3 mm Biopsy Punches Kai Medical Handle with care – extremely sharp
Tygon Tubing Fisher Scientific S-50-HL 1.65 mm ID; 3.35 mm OD
1 mL Syringe (Inkjekt and Omnifix) Braun 6064204
4-Way Tubing Connector VWR or Fisher Scientific
Flow Regulator Harvard Apparatus 722645
0.5 mm Pins Dressmaking Departments
PLL-g-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) Stability in storage can be an issue
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407
poly-lysine-FITC Sigma-Aldrich P3069
poly-ornithine Sigma-Aldrich P4957
fibronectin Sigma-Aldrich F2006
laminin Sigma-Aldrich L2020
PBS Sigma-Aldrich P4417
Inverted Fluorescent Microscope
Example Aspiration Pump KNF Neuberger, Laboport N811KVP
Hand Held Corona Discharge Device Leybold-Heraeus, USA VP23 May not comply with your country's safety standards
Femto Plasma Oven Diener Electronic
Vacuum Dessicator or Centrifuge

References

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Citer Cet Article
Dinh, N., Chiang, Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).

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