إعداد العصبية المشارك الثقافات واحدة مع الدقة الخليوي
Summary
يتم وصف بروتوكولات لاحد الخلايا العصبية ميكروفلويديك arraying واخفاء المياه للالزخرفة البلازما الطلاء مادة بيولوجية في رقاقة. مترابطة للغاية المشترك الثقافات يمكن إعدادها باستخدام الحد الأدنى من المدخلات الخلية.
Abstract
وقد اجتذبت تجسيد ميكروفلويديك للغرفة Campenot اهتماما كبيرا من المجتمع الأعصاب. هذه المنصات شارك في الثقافة مترابطة يمكن استخدامها لتحقيق مجموعة متنوعة من الأسئلة، والتي تمتد بيولوجيا الأعصاب التنموية والوظيفية للعدوى وانتشار المرض. ومع ذلك، الأنظمة التقليدية تتطلب مدخلات هامة الخلوية (عدة آلاف في المقصورة)، وعدم كفاية لدراسة الخلايا وفرة منخفضة، مثل الدوبامين substantia الرمادية الأولية، دوامة العقد، وDrosophilia الخلايا العصبية البطن، وغير عملي بالنسبة لإنتاجية عالية التجريب. كما متشابكا للغاية محليا الثقافات الكثيفة، مع عدد قليل من الامتداد (<10٪) ربط الثقافتين. في هذه الورقة تم وصفها بروتوكولات ميكروفلويديك والزخرفة واضحة تعالج هذه التحديات: (ط) عصبون واحد ميكروفلويديك arraying الأسلوب، و (ب) طريقة اخفاء المياه عن الزخرفة البلازما الطلاء مادة بيولوجية لريجيستير الخلايا العصبية وتعزيز نمو بين المقصورات. أعدت أضيق الحدود العصبية المشترك الثقافات مع مستوى عال (> 85٪) الربط intercompartment ويمكن استخدامها لإنتاجية عالية الدقة مع التجارب بيولوجيا الأعصاب خلية واحدة.
Introduction
الأنسجة العصبية هي معقدة للغاية؛ خليط غير متجانس الخلوية التي أمرت مكانيا داخل طبقات ومقصورات المعرفة والربط مع البلاستيك عن طريق الاتصال الخليوي، وخصوصا عن طريق محور عصبي والتغصنات الامتداد. ويلزم تقنيات جديدة لمنح مزيد من الحرية التجريبية لاكتساب رؤى أعمق وآليات تنحل المركزية للمرض، والتنمية، وظيفة صحية. غرفة Campenot 1،2 و microfabricated مؤخرا تجسيد 3،4 يمكن استخدامها لخارج الحي إعداد الشبكات العصبية المشترك الثقافات، مع القدرة على التشويش انتقائي السكان جسدية مختلفة، وأيضا الامتداد محوار بهم. وعلى سبيل المثال تم استخدام هذه الأجهزة ميكروفلويديك لدراسة تنكس محور عصبي والتجديد التالية الكيميائية أو الليزر 5،6 axotomy 6-8، tauopathy 9، نشر الفيروسية 10،11، ومرنا في توطين المحاور 4.
الأنف والحنجرة ">لتوسيع نطاق من بيولوجيا عصبية، يطلب من التطورات التكنولوجية لإعداد أضيق الحدود العصبية المشترك الثقافات. وهذا يتيح disentanglement الشبكة العصبية للتحقيق في النظام مع خلية واحدة والدقة شبه الخلوية. متطلبات الحد الأدنى من أعداد الخلايا يفتح إمكانية لتحليل أنواع الخلايا النادرة، بما في ذلك خلايا الدوبامين substantia الرمادية ذات الصلة لمرض باركنسون، والعقد دوامة من الأذن، الخلايا العصبية الطرفية، والخلايا الجذعية. أبعد من ذلك، والاقتصاد الخلوية هي ذات الصلة إلى المبادرة 3RS. باستخدام هذه المنصات ميكروفلويديك، شاشات سمية على نطاق واسع أو غيرها من إنتاجية عالية، سلسلة البيانات التجريبية الغنية التي تتطلب الخلايا العصبية الحيوانية ويمكن الآن النظر فيها.
في هذه الورقة تم وصفها بروتوكولات لتصنيع واستخدام جهاز ميكروفلويديك. arraying ميكروفلويديك في تركيبة مع biomateri في الموقع آل أسلوب الزخرفة يمكن استخدامها لتسجيل مترابطة للغاية العصبية المشترك الثقافات باستخدام أرقام الخلية الحد الأدنى. ويستند arraying ميكروفلويديك على نهج تدفق التفاضلية 12-15، حيث يتم وضع الشراك microstructured داخل الدائرة فلويديك (موضح جنبا إلى جنب مع الصور ووزارة شؤون المرأة في الشكل 1). المسار 0 → 1 ديه مقاومة أقل فلويديك (R 2> R 1) لنقل الخلايا العصبية لمجموعة خطية من فتحات microstructured – مداخل إلى قنوات ثمرة neurite. شغل في فخ من قبل خلية واحدة يعوق تدفق محليا لتحويل يبسط لمحاصرة الخلايا اللاحقة في الفخاخ المجاورة. الإشغال كاملة من الفخاخ في مجموعة مفاتيح نسبة فلويديك (R 1> R 2) لتحويل يبسط في طريق اعوج (0 → 2) لإنتاج وضع الالتفافية من عملية لإزالة الخلايا العصبية الزائدة.
<p claق ق = "jove_content" fo: المحافظة على together.within صفحة = "دائما">
الشكل 1. ميكروفلويديك الدائرة. أ) الدائرة المقاومة التفاضلية فلويديك لarraying الخلايا العصبية واحد، مع المرافقة غرف ثقافة مترابطة عن طريق قنوات ثمرة neurite. B، C الصور) ووزارة شؤون المرأة من طبقة ثنائية الخلايا العصبية مجزأة شارك في ثقافة مجموعة مع الغضروف المفصلي تعلق micropillars. مع هذا التصميم، استخدمت الهياكل العصبية محاصرة على شكل ترايدنت لتعزيز تليف من الامتداد محوار. الرقم وأسطورة تتكرر بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء (RSC) 12. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
يمكن بسهولة أن يتحقق إعداد الشبكات العصبية micropatterned على ركائز مستو (لالامثله وفاق من مجموعتنا، انظر Frimat وآخرون 16 وهايكه وآخرون 17). ومع ذلك، التغليف أنماط المواد النشطة بيولوجيا داخل الأجهزة PDMS ومع متطلبات المواءمة ميكرومتر نطاق هذه إلى قنوات ميكروفلويديك يشكل تحديا تقنيا كبيرا. في القسم 3.1 في رقاقة، أو في الموقع، ويقدم إعداد أنماط بيولوجية بروتوكول لل. هذه الأنماط تمكين تسجيل الخلايا العصبية خلال فترات زمنية مطولة وتعزيز ثقافة الامتداد بين المقصورات. وتستخدم المجهرية الغضروف المفصلي، تعلق لمحاذاة ما يسمى قناع المياه مع الخلايا العصبية arraying المواقع والقنوات ثمرة neurite. قناع يحمي الطلاء المياه جزيء التصاق أثناء العلاج البلازما، بينما تفككت الأسطح المكشوفة لتعريف نمط مادة بيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير بروتوكولات لخلية ثقافة والعزلة فلويديك اللازمة لعلاج انتقائية لمختلف المقصورات ثقافة مشتركة.
ve_content "> تم تصميم بروتوكولات للاستفادة من المبادئ الصديقة للمستخدم الطباعة الحجرية الناعمة لتكرار بولي (dimethylsiloxane) (PDMS) الأجهزة ميكروفلويديك 18. وبالمثل، مادة بيولوجية في الوضع الطبيعي الزخرفة واضح ومباشر، واستغلال التبخر والسطح ظواهر التوتر، وفقط تتطلب باليد مصدر البلازما غير مكلفة. الدائرة ميكروفلويديك فعالية العلاجات برامج التحميل ومقصورة خلية محددة مما يجعل هذه العمليات مجرد مسألة الاستغناء المواد في منفذ أسفل الصحيح والشفط من فوق. وبهذه الطريقة، فإنه يهدف إلى إعطاء بيولوجيا عصبية الحرية لإعداد واستخدام أجهزة ميكروفلويديك في المختبرات الخاصة.Protocol
Representative Results
Discussion
تقنية arraying ميكروفلويديك هو الأول من نوعه الذي يتيح دقة التعامل مع الخلايا العصبية واحد لإنشاء الثقافات في أضيق الحدود. إلى جانب الوضع الطبيعي أسلوب الزخرفة مادة بيولوجية في، نهج قوية لمواءمة أنماط الخلية مع هياكل ميكروفلويديك، هذه الثقافات في أضيق الحدود …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفون ممتنون لأولريش Marggraf (ISAS) لSU-8 تلفيق وماريا بيكر (ISAS) لSEM التصوير. وأيد هذا البحث من الناحية المالية من قبل دويتشه FÜR للبحوث (DFG WE3737/3-1)، وهي منحة Bundesministerium Bildung اوند Forschung (BMBF 0101-31P6541) وقبل Ministerium FÜR الابتكار، Wissenschaft اوند Forschung قصر اندز نوردراين فيستفالن. هايكه Hardelauf بفضل المدرسة الدولية لايبنتز العليا "بيولوجيا الأنظمة المختبر على واحد في رقاقة" للحصول على الدعم المالي.
Materials
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| PDMS Elastosil RT 601 | Wacker | ||
| Coverslips | VWR | 630-1590 | 130-160 mm thick |
| 3 mm Biopsy Punches | Kai Medical | Handle with care – extremely sharp | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | S-50-HL | 1.65 mm ID; 3.35 mm OD |
| 1 mL Syringe (Inkjekt and Omnifix) | Braun | 6064204 | |
| 4-Way Tubing Connector | VWR or Fisher Scientific | ||
| Flow Regulator | Harvard Apparatus | 722645 | |
| 0.5 mm Pins | Dressmaking Departments | ||
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Stability in storage can be an issue |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| poly-lysine-FITC | Sigma-Aldrich | P3069 | |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Inverted Fluorescent Microscope | |||
| Example Aspiration Pump | KNF Neuberger, Laboport | N811KVP | |
| Hand Held Corona Discharge Device | Leybold-Heraeus, USA | VP23 | May not comply with your country's safety standards |
| Femto Plasma Oven | Diener Electronic | ||
| Vacuum Dessicator or Centrifuge |
References
- Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74 (10), 4516-4519 (1997).
- Campenot, R. B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor. Dev Biol. 93 (1), 1-12 (1982).
- Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 559-565 (2005).
- Kilinc, D., et al. Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip. Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).
- Li, L., et al. Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics. Anal. Chem. 84 (15), 6444-6453 (2012).
- Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons. Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).
- Hellman, A. N., et al. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab Chip. 10 (16), 2083-2092 (2010).
- Kunze, A., et al. Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies. Biotechnol. Bioeng. 108 (9), 2241-2245 (2011).
- Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus. PLoS One. 3 (6), (2008).
- Markus, A., et al. Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection. J. Virol. 85 (13), 6220-6233 (2011).
- Dinh, N. D., et al. Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures. Lab Chip. 13 (7), 1402-1412 (2013).
- Tan, W. H., Takeuchi, S. A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (4), 1146-1151 (2007).
- Frimat, J. -. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (14), 4925-4930 (2006).
- Frimat, J. P., et al. The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening. Lab Chip. 10, 701-709 (2010).
- Hardelauf, H., et al. High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes. Lab Chip. 11 (16), 2763-2771 (2011).
- Whitesides, G. M., et al. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Frimat, J. P., et al. Plasma stencilling methods for cell patterning. Anal. Bioanal. Chem. 395 (3), 601-609 (2009).
- Huang, N. P., et al. Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption. Langmuir. 17, 489-498 (2001).
- Li, N., Folch, A. Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates. Exp. Cell Res. 311 (2), 307-316 (2005).
- Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304 (5673), 987-990 (2004).
- Yang, Z., et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. J. R. Soc. Interface. 7, (2010).
- Brenneman, K. A., et al. Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model. Toxicol. Appl. Pharm. 169 (3), 238-248 (2000).
- Magalães, A. C., et al. Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells. J. Neurosci. 25 (21), 5207-5216 (2005).
- Diogenes, M. J., et al. Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation. J Neurosci. 32 (34), 11750-11762 (2012).
- Egger, B., et al. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nat. Protoc. 8 (5), 958-965 (2013).
