Summary

세포 배양과 병아리 배아에서 축슨 유도 수용체의 역학을 평가하기 위해 pHluorin의 사용

Published: January 12, 2014
doi:

Summary

우리는 여기에서 pH 에 민감한 녹색 형광 단백질 변이체, pHluorin의 사용을 설명, 축 슨 유도 수용체의 스파티오-측두동역학을 연구 하는 세포 표면에 인신 매매. pHluorin 태그 수용체는 병아리 배아의 전기 기공을 사용하여 세포 배양 및 생체 내에서모두 표현된다.

Abstract

개발 하는 동안, 축 하 안내 수용 체 매력적이 고 반발 단서 모두에 축 슨 감도 조절에 중요 한 역할을. 실제로, 유도 수용체의 활성화는 축축기 팁, 성장 콘, 리간드에 반응하는 신호 메커니즘의 첫 번째 단계이다. 따라서 셀 표면에서의 가용성을 조절하는 것은 성장 원뿔 감도 설정에 참여하는 메커니즘 중 하나입니다. 우리는 여기에서 개발 중인 병아리 척수에서 체외생체 내 모두에서 축소 유도 수용체의 현세세포 표면 역학을 정확하게 시각화하는 방법을 설명합니다. 우리는 플라즈마 막에 해결되는 축축물 유도 수용체의 분획을 구체적으로 검출하기 위해 녹색 형광 단백질 (GFP) 변이체의 pH 의존형 형광 특성을 이용했습니다. 우리는 먼저 이러한 pH 의존 구조의 체외 검증을 설명하고 우리는 더 관심축산축산구체의 스페티오 -측두동역학을 평가하기 위해, 병아리 척추 화음에서 생체 내에서의사용을 자세히 설명합니다.

Introduction

탐색 하는 동안 축 하 그들의 대상을 향해 그들을 안내 하는 여러 환경 단서를 통합. 이러한 단서는 축축단 단자 표면의 안내 수용체를 활성화, 성장 콘, 차례로 적절한 신호 경로를 시작합니다. 따라서, 수용체의 세포 표면 분포의 시간적 및 공간 조절은 성장 원뿔1의감도를 설정하는 데 중요하다. 이러한 맥락에서, 상생축축에 의한 중간선 횡단은 수용체 세포 표면 수준의 조절을 조사하는 우수한 모델이다. 개발 척수에서, commissural 축축은 처음에 그들이 중간라인을 건너 복부 바닥 플레이트쪽으로 끌리고 있습니다. 횡단 후, 그들은 바닥 플레이트 매력에 대한 응답성을 잃고 바닥 판 기피제에 대한 반응을 얻어 서 바닥 판을 빠져 나와 신경계2,3의단점 면에서 최종 목적지로 이동할 수 있습니다. 성장 콘 표면에서 수용체 가용성의 조절은 미드 라인 큐4,5에응답의 전환의 기초 메커니즘 중 하나입니다. 따라서, 성장 콘의 혈장 막에 존재하는 수용체의 선택적 모니터링은 매우 중요하다. 당사는 개발 중인 병아리 척수에서 시험관 내 및 생체 내 혈장 막에 해결되는 축축 유도 수용체를 구체적으로 시각화하기 위해 녹색 형광 단백질(GFP) 변이체의 pH 의존형 형광 성질을기반으로 하는 방법을 설명한다.

로스만 과 동료는 일식 pHluorin6을포함하여 GFP의 포인트 돌연변이 pH 민감 변이체에 의해 설계되었다. 이클립성 pHluorin은 산성 pH (<6)에 노출될 때 불형성인 성질을 가지며, 중성 pH에서 형광이 되는 동안. 이를 통해 세포내 산성구획(즉, 내성, 인신매매 소포)에서 국소화된 비형성 수용체를 혈장 막에 통합하여 세포외 중립 pH7에노출된 형광 수용체로부터 구별할 수 있다. 이를 통해 미들라인 충충제 세마포린 3B5(도 1A)에 대한 성장 콘 반응을 중재하는 축삭 유도 수용체인 plexinA1의 플라즈마 막 국소화를 모니터링하였다. 우리는 여기에 pHluorin-plexinA1 구조의 체외 특성화를 설명, 개발 병아리 척수에서이 구조의 오보 전기화8-10에 다음 공간 및 측두해상도 모두 생체 내에서 축삭 유도 수용체 역학을 따를 수 있도록 극저온 섹션의 현미경 분석.

Protocol

1. pHluorin와 플렉스A1 수용체를 태그하는 복제 전략 백본으로서 적절한 발현 벡터를 선택한다(예를들어 마우스 수용체 plexinA1 발현 벡터, 안드레아스 푸스헬 박사의 종류 선물11).참고: 이 플렉스A1 벡터는 플라즈마 멤브레인에서 효율적인 HA-또는 VSV 태그 수용체 삽입을 달성하기 위해 설계되었습니다. PCR에 의해 증폭되는 이클립성 pHluorin 코딩 서열은 적절한 플라스?…

Representative Results

그림 1. A. 세포 컨텍스트에서 pHluorin-plexinA1 형광 특성의 계획. PHluorin은 pH가 인신 매매 vesicules 또는 내분모에서와 같은 산성 (<6)이며 pH가 중성인 세포 외 배지에 노출되면 형광인 세포 내 구획에서 비형성입니다. 이를 통해 pHluorin-plexinA…

Discussion

이 프로토콜은 세포 배양과 병아리 배아 척수의 발달 맥락에서 축축한 유도 수용체의 역학을 따르는 단계별 절차를 제공합니다.

드 노보 pHluorin 태그 단백질을 설계하려면 복제 전략에 관한 두 점을 고려해야합니다. 먼저, pHluorin 태그는 산성 내종의 루멘에 노출되어야하며, 결과적으로 혈장 막 수용체 풀을 시각화하기 위해 세포외 구획에 노출되어야 한다. 따라서, 수?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

호미라 나와비, 프레드릭 모트, 이자벨 산야스의 도움에 감사드립니다. 이 작품은 CNRS에 의해 지원됩니다, 협회 프랑카이스 contre 레 Myopathies (AFM), ANR YADDLE, 라벡데베칸, 라벡스 피질, V.C.; C.D-B와 A.J는 라 리그 콘트레 르 암과 라벡스 DevWeCan 펠로우십에 의해 각각 지원됩니다.

Materials

COS7 cells ATCC CRL-1651
DMEM GlutaMAX GIBCO 61965-026
Sodium pyruvate GIBCO 11360-039
Amphotericin B Sigma A2942
Fetal bovine serum GIBCO 10270-106
Penicillin/Streptomycin GIBCO 15140-122
Exgen500 reagent Euromedex Fermentas ET0250
PBS -Ca2+ -Mg2+ GIBCO 14190-094
Fast green dye Sigma F7252
32% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy 15714-S Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution
Gelatin from cold water fish skin Sigma G7041
Sucrose Sigma S0389
Cryomount Histolab 00890
Hoechst 34580 Invitrogen H21486
Mowiol 4-88 Fluka 81381
Consumables
Bottom-glass 35 mm dish MatTek P35G-1.5-14-C
5 ml Syringe Terumo SS-05S
Needles 0.9 mm x 25 mm Terumo NN-2025R
Capillaries CML PP230PO capillaries are stretched manually in the flame
Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951PLUS
Material
Curved scissors FST 129-10
Microscalpel FST 10316-14
Forceps FST Dumont #5 REF#11254
Equipment/software
Time lapse microscope Zeiss Observer 1
Temp module S PECON for Zeiss
CO2 module S PECON for Zeiss
Metamorph software Metamorph
Eggs incubator Sanyo MIR154
Electroporator apparatus Nepa Gene CO., LTD CUY21
Electrodes Nepa Gene CO., LTD CUY611P7-4 4 mm platinum electrodes
Fluorescence stereomicroscope LEICA MZ10F
Cryostat MICROM HM550
Confocal microscope Olympus FV1000, X81
Fluoview software Olympus
CLC Main Workbench software CLC Bio

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Citer Cet Article
Delloye-Bourgeois, C., Jacquier, A., Falk, J., Castellani, V. Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo. J. Vis. Exp. (83), e50883, doi:10.3791/50883 (2014).

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