Summary

Utilisation de la pHluorine pour évaluer la dynamique des récepteurs de guidage axonaux dans la culture cellulaire et dans l’embryon de poussin

Published: January 12, 2014
doi:

Summary

Nous décrivons ici l’utilisation d’une variante fluorescente verte pH-sensible de protéine, pHluorin, pour étudier la dynamique spatio-temporelle des récepteurs de guidage axon en trafic à la surface cellulaire. Le récepteur marqué par la pHluorine est exprimé à la fois en culture cellulaire et in vivo, enutilisant l’électroporation de l’embryon de poussin.

Abstract

Au cours du développement, les récepteurs de guidage axonaux jouent un rôle crucial dans la régulation de la sensibilité des axones aux signaux attrayants et répulsifs. En effet, l’activation des récepteurs de guidage est la première étape des mécanismes de signalisation permettant aux pointes axoniques, les cônes de croissance, de répondre aux ligands. En tant que tel, la modulation de leur disponibilité à la surface de la cellule est l’un des mécanismes qui participent à la définition de la sensibilité du cône de croissance. Nous décrivons ici une méthode pour visualiser avec précision la dynamique de surface spatio-temporelle de cellules d’un récepteur de guidage axone in vitro et in vivo dans la moelle épinière de poussin en développement. Nous avons tiré parti de la propriété de fluorescence pH-dépendante d’une variante verte de protéine fluorescente (GFP) pour détecter spécifiquement la fraction du récepteur de guidage axone qui est adressée à la membrane plasmique. Nous décrivons d’abord la validation in vitro de telles constructions pH-dépendantes et nous détaillons plus loin leur utilisation in vivo,dans la moelle épinière de poussin, pour évaluer la dynamique spatio-temporelle du récepteur axon de guidage d’intérêt.

Introduction

Lors de leur navigation, les axones intègrent de multiples indices environnementaux qui les guident vers leur cible. Ces signaux activent les récepteurs de guidage à la surface des bornes axoniques, les cônes de croissance, qui à leur tour initient une voie de signalisation appropriée. Ainsi, la régulation temporelle et spatiale de la distribution de surface cellulaire des récepteurs est essentielle pour définir la sensibilité du cône de croissance1. Dans ce contexte, le croisement de la ligne médiane par les axones commissuraux est un excellent modèle pour étudier la régulation des niveaux de surface des cellules réceptrices. Dans la moelle épinière en développement, les axones commissuraux sont initialement attirés vers la plaque ventrale du plancher où ils traversent la ligne médiane. Après la traversée, ils perdent leur réactivité aux attractifs de la plaque de plancher et gagnent en réponse aux répulsifs de plaque de plancher afin qu’ils puissent sortir de la plaque de plancher et naviguer vers leur destination finale dans le côté controlatéral du système nerveux2,3. La régulation de la disponibilité des récepteurs à la surface du cône de croissance est l’un des mécanismes sous-jacents au changement de réactivité aux signaux médians4,5. Ainsi, la surveillance sélective des récepteurs présents à la membrane plasmique des cônes de croissance est d’une importance primordiale. Nous décrivons ici une méthode basée sur la propriété de fluorescence pH-dépendante d’une variante verte de protéine fluorescente (GFP) pour visualiser spécifiquement les récepteurs de guidage axonaux qui sont adressés à la membrane plasmique in vitro et in vivo,dans la moelle épinière de poussin en développement.

Rothman et ses collègues ont conçu par des mutations ponctuelles des variantes sensibles au pH de la GFP, y compris le pHluorin écliptique6. Le pHluorin écliptique a la propriété d’être non fluorescent lorsqu’il est exposé à un pH acide (<6), tout en étant fluorescent à pH neutre. Cela permet de distinguer les récepteurs non fluorescents localisés dans les compartiments acides intracellulaires(c’est-à-dire endosomes, vésicules de trafic) des récepteurs fluorescents incorporés à la membrane plasmique et donc exposés au pH neutre extracellulaire7. Nous en avons profité pour surveiller la localisation de la membrane plasmique de la plexineA1, un récepteur de guidage axone médiant la réponse du cône de croissance à la sémaphorine répulsifique médiane 3B5 (figure 1A). Nous décrivons ici la caractérisation in vitro d’une construction pHluorin-plexinA1, avec l’électroporation8-10 in ovo de cette construction dans la moelle épinière de poussin se développante suivie de l’analyse microscopique des cryosections qui permettent de suivre la dynamique de récepteur de guidage d’axone in vivo avec des résolutions spatiales et temporelles.

Protocol

1. Stratégie de clonage pour marquer le récepteur PlexinA1 avec pHluorin Choisissez un vecteur d’expression approprié comme épine dorsale(par exemple, le vecteur exprimant le récepteur de la souris plexineA1, un don gentil du Dr Andreas Puschel11).Remarque: Ce vecteur plexinA1 a été conçu pour réaliser l’insertion efficace de récepteur HA- ou VSV-marqué dans la membrane plasmique. Amplifier par PCR la séquence codante de la pHluorine écliptique en utilisant le …

Representative Results

Figure 1. A. Schéma des propriétés de fluorescence de la pHluorine-plexineA1 dans un contexte cellulaire. La pHluorine est non fluorescente dans les compartiments intracellulaires où le pH est acide (<6) comme dans les vésicules en trafic ou dans les endosomes et est fluorescente lorsqu’elle est expos…

Discussion

Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour suivre la dynamique d’un récepteur de guidage axone à la fois dans la culture cellulaire et dans le contexte développemental de la moelle épinière de l’embryon de poussin.

Pour concevoir une protéine marquée par la pHluorine de novo, deux points doivent être pris en compte concernant la stratégie de clonage. Tout d’abord, la balise de pHluorin devrait être exposée à la lumière des endosomes acides, et par co…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Homaira Nawabi, Frederic Moret et Isabelle Sanyas pour leur aide. Ces travaux sont soutenus par le CNRS, Association Française contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA à V.C. ; C.D-B et A.J sont soutenus respectivement par les bourses De la Ligue contre le cancer et du Labex DevWeCan.

Materials

COS7 cells ATCC CRL-1651
DMEM GlutaMAX GIBCO 61965-026
Sodium pyruvate GIBCO 11360-039
Amphotericin B Sigma A2942
Fetal bovine serum GIBCO 10270-106
Penicillin/Streptomycin GIBCO 15140-122
Exgen500 reagent Euromedex Fermentas ET0250
PBS -Ca2+ -Mg2+ GIBCO 14190-094
Fast green dye Sigma F7252
32% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy 15714-S Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution
Gelatin from cold water fish skin Sigma G7041
Sucrose Sigma S0389
Cryomount Histolab 00890
Hoechst 34580 Invitrogen H21486
Mowiol 4-88 Fluka 81381
Consumables
Bottom-glass 35 mm dish MatTek P35G-1.5-14-C
5 ml Syringe Terumo SS-05S
Needles 0.9 mm x 25 mm Terumo NN-2025R
Capillaries CML PP230PO capillaries are stretched manually in the flame
Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951PLUS
Material
Curved scissors FST 129-10
Microscalpel FST 10316-14
Forceps FST Dumont #5 REF#11254
Equipment/software
Time lapse microscope Zeiss Observer 1
Temp module S PECON for Zeiss
CO2 module S PECON for Zeiss
Metamorph software Metamorph
Eggs incubator Sanyo MIR154
Electroporator apparatus Nepa Gene CO., LTD CUY21
Electrodes Nepa Gene CO., LTD CUY611P7-4 4 mm platinum electrodes
Fluorescence stereomicroscope LEICA MZ10F
Cryostat MICROM HM550
Confocal microscope Olympus FV1000, X81
Fluoview software Olympus
CLC Main Workbench software CLC Bio

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Citer Cet Article
Delloye-Bourgeois, C., Jacquier, A., Falk, J., Castellani, V. Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo. J. Vis. Exp. (83), e50883, doi:10.3791/50883 (2014).

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