在这篇文章中,我们描述了完整的实验程序来重建,具有分辨率高,荧光标记的小鼠大脑的优良大脑解剖。所描述的协议包括样品制备和清算,样品安装成像,数据后处理和多尺度可视化。
理解哺乳动物大脑的结构在单细胞分辨率是神经科学的关键问题之一。然而,在整个大脑的神经元映射胞体和预测仍是成像和数据管理技术的挑战。事实上,宏观的卷需要具有高分辨率和对比度重建在合理的时间,生产的TB级范围内的数据集。我们最近展示了一种光学方法(光共聚焦显微镜片,激光共聚焦显微镜),能够获得标记与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)整个老鼠大脑的微米级重建。结合光板照明和激光共聚焦检测,激光共聚焦显微镜可以让深层成像内宏观清除标本具有高对比度和速度。在这里,我们描述了完整的实验管道获得标有荧光蛋白整个老鼠大脑的全面和人类可读的影像。结算及安装procedures进行了描述,连同步骤通过获取许多平行相邻的堆叠在其整个体积中进行光学断层摄影术。我们发现开源定制软件工具使多个栈和多分辨率的数据导航的拼接使用。最后,我们示出脑映射的一些例子:从L7-GFP转基因小鼠,其中所有的浦肯野细胞的选择性标记,以及从THY1-GFP-M鼠标,其特征在于由一个随机稀疏神经元标记的全脑小脑。
相较于我们的细胞和分子机制基本脑功能的了解,我们的优良神经解剖学的知识,看起来还处于起步阶段1。事实上,我们还缺乏长期预测中的神经元胞体或整个大脑的位置综合地图。事实上,许多技术努力致力于重建小鼠大脑与微观的分辨率。根据树脂包埋标本,连续切片的光学方法,刀口扫描显微镜(KESM)2,微光学切片层析成像(MOST)3和荧光MOST(fMOST)4,可提供亚微米的三维解析成像整个鼠标的大脑。然而,所需要的单个样品的制备和成像的总时间是几个星期的数量级,限制了这种方法的实际应用。基于连续切片的另一项技术(但没有树脂包埋),串行双光子断层扫描(STP)5,允许高三维高分辨率成像。然而,该技术已被证明在整个小鼠脑中只用非常稀疏采样,采集1段每50微米5,并以我们的知识STP没有产生又一个鼠大脑的完整采样重建。
在高速重建整个标本的三维尖端的光学方法是轻质板材镜6。在该光学方案的样品被照射的薄光片和荧光发射是沿垂直于所述照明平面的轴线收集。以这种方式仅在焦荧光被激发,这是能够实现宽视场配置的光学切片,以保证高的帧速率。当联接到清除基于水的折射率匹配液7的取代的协议,光片显微镜已经被应用到宏观标本,作为整个老鼠大脑8。然而,样品诱导的光散射,这会影响甚至清除标本,降低了光片导致的离焦的荧光团的激发这增加了整体的模糊所获取的图像。
有选择地收集仅在对焦光子,我们最近耦合光片照射到激光共聚焦检测方案9。在共焦光片显微镜(CLSM),出焦和散射光子被一个线性空间滤波器(狭缝)在检测之前( 图1)拒绝。为了实现在光片建筑共焦操作时,该照明用的扫描线的装置产生,而在检测路径的去扫描系统创建在狭缝的位置的激发扫描线的静态图像。第三扫描系统重建的二维图像上的相机传感器。激光共聚焦显微镜能提供在清理鼠标100%对比度增强同时保持10赫兹帧频的大脑相对于传统光片镜。用激光共聚焦显微镜能够重建整个老鼠大脑为2μm的XY和9微米的Z轴分辨率,并具有足够的对比度,以识别单个荧光标记的神经元。
在本文中,我们描述了实验管道重建小鼠的大脑与激光共聚焦显微镜。醛固定小鼠的大脑梯度脱水系列的无过氧化物的四氢呋喃,并随后被清除在无过氧化物的二苄醚( 图2),下面通过Becker 等人 10的清零标本开发的协议,然后小心地安装在一尖板放置在一个特制的激光共聚焦光片显微镜成像室。样品可以直接安装通过在板( 图3a)的前端切入它;备选地它可以清除琼脂糖凝胶上的盘( 图上被粘图3b),或放置在作出清零琼脂糖凝胶( 图3c)的烧杯中的空腔中。然后进行整个大脑的光学断层扫描,因为被收购的许多平行相邻堆覆盖所有的脑容量( 图4)。预断层扫描采样,产生的样本位置和形状的粗略地图,保证只在由样本所占的体积进行成像。该断层栈随后缝合在一起使用自制软件,并保存在一个多分辨率分层方案11。老鼠大脑最终可以探索与原型多分辨率谷歌地图般的可视化软件。这两个软件工具集成为开源平台Vaa3D 12插件。
最终推导出的小鼠大脑的代表图像来演示在研究小鼠精的neuroanatom描述实验管道的能力年。
激光共聚焦显微镜加上化学清算代表一个功能强大的工具来研究标记的荧光探针,无论是蛋白质或合成染料整个老鼠大脑的神经解剖学。由于焦平面以外发出的光被一个物理空间滤波器,高对比度的成像是可能的也是厚厚的标本,同时保持高帧率典型的轻质板材建筑。
主要的问题来处理使用所描述的方法时,与是的对比度最大化。实际上,可用的信号都通过化学和光学因素降低。从化学角度来看,基于有机溶剂的清关程序可以从荧光蛋白和其他荧光染料7解渴排放。作为溶剂,过滤以除去过氧化物,如由Becker 等人 10,允许保持荧光的良好水平也是在溶剂被清除的组织。发布编辑水性结算方法14不降低荧光效率,反而会导致透明度较差,与整个鼠大脑处理,至少在非线性光学技术。
在另一方面,在目前有有长 工作距离的高折射率(n≈1.56)结算使用的解决方案纠正任何商业目的。因此,在该样品浸入介质和物镜的设计1之间的折射率失配产生了强烈的球面像差。除了减少显微镜的分辨率,这样的像差导致的下降的图像亮度和对比度时,由于光被铺展在更广阔的领域。可能的解决方法对这个问题包括使用自适应光学系统15和/或静态非球面校正器。
任何改善图像的对比度和亮度也很容易影响到成像的速度,因为在短每幅图像tegration时间可以选择。此刻CLSM可以承受大约10 6微米3 /秒的成像速度,以100毫秒9的照相机的曝光时间。在此速度下需要从1-3天到图像的整个鼠脑,这取决于样品的大小。虽然在图像质量没有显著下降在整个这么长的成像会议的光片照射6固有的低光漂白主要是因为,观察到的,很长一段时间需要像一个鼠标的大脑可以在实践中减少CLSM的适用性。一个10倍的系统效率,加上采用高速摄像头进行检测,将减少成像时间为几个小时,让日常使用所描述的协议。
尽管所有的上述局限性,激光共聚焦显微镜成像耦合到组织许可证化学结算重建整个老鼠大脑与微米级分辨率,在不到一个一周。其他光学方法全脑成像能力在较长的准备和/或成像时间2-4的价格,或稀疏Ž采样5的分辨率比激光共聚焦显微镜高,但。
本文中介绍的方法可以在与荧光标记不同的策略组合使用:转基因动物表达在选定的神经元亚群,病毒转染,脑实质内注射染料等荧光蛋白在实践中,动物牺牲前所有染色战略与激光共聚焦显微镜兼容。事实上,整个老鼠大脑中的验尸报告荧光标记,未能证实到现在,无论如何,如果此类染色将有可能在不久的将来,可与激光共聚焦显微镜重建标本的数量将变得更大,可能包括人脑组织。
总之,在使用与TIS组合共聚焦光片显微镜起诉清算和多分辨率的数据管理可以使研究人员重建和分析宏观标本在微米级分辨率,与那些在好大多数实验室的手技改力度。激光共聚焦显微镜的潜在应用当然不限于神经系统科学,但涵盖所有中,轻质板材镜已被使用的研究领域,如胚胎发育16,17和小动物18的解剖。
The authors have nothing to disclose.
这项研究导致这些结果根据出让协议已收到的资金来自欧盟第七框架计划(FP7/2007-2013)号码n。 228334和241526。这一研究项目也已支持人类前沿科学计划的研究经费(RGP0027/2009),以及由意大利教育部教育,大学和研究中的旗舰项目NANOMAX的框架,并通过在意大利的框架卫生部“干细胞提案征集”。这项研究已经进行了的图标地基“恩特卡萨迪Risparmio Di Firenze酒店”支持的研究活动的框架。
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Phosphate Buffered Saline Tablets | Sigma-Aldrich | P4417_100TAB | |
Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
Peroxide-free Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 186562 | |
Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
Butylated hydroxytoluene | Sigma-Aldrich | W218405 | |
Agarose Type III-A, High EEO | Sigma-Aldrich | A9793 | |
Acrylic glue | Bostik | D2498 | |
Vaa3D software | open source | freely downloadable from http://www.vaa3d.org/ |