공 초점 빛 시트 현미경 전체 마우스 두뇌의 마이크론 규모의 해상도 광학 단층 촬영
Summary
이 문서에서 우리는 높은 해상도, 형광 표지 된 마우스의 뇌의 미세 뇌 해부학과, 재구성하는 전체 실험 절차를 설명합니다. 설명 프로토콜은 샘플 준비 및 청소, 영상, 데이터 후 처리 및 다중 스케일의 시각화를 위해 설치 표본이 포함되어 있습니다.
Abstract
단일 셀 해상도에서 포유 동물의 뇌의 구조를 이해하는 것은 신경 과학의 주요 이슈 중 하나입니다. 그러나, 뇌 전체에 걸쳐 신경 소마와 전망을 매핑 여전히 이미징 및 데이터 관리 기술에 대한 도전입니다. 사실, 거시적 인 볼륨은 테라 바이트 범위의 데이터 세트를 생산, 적당한 시간에 높은 해상도와 콘트라스트 재구성 될 필요가있다. 우리는 최근 광학 방법 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)로 표지 전체 마우스 뇌의 마이크론 규모의 재건을 얻을 수 (공 초점 빛 시트 현미경, CLSM)를 보여 주었다. 빛 시트 조명 및 공 초점 검출을 결합, CLSM 고 대비 및 속도 거시적 삭제 표본 내부 깊은 영상을 수 있습니다. 여기에서 우리는 형광 단백질로 표지 전체 마우스 두뇌의 포괄적이고 사람이 읽을 수있는 이미지를 얻기 위해 실험을 할 파이프 라인을 설명합니다. 청산 장착 Procedures 함께 많은 병렬 인접 스택을 획득하여 전체 볼륨에 광학 단층 촬영을 수행하는 단계를 설명합니다. 우리는 여러 스택 및 다중 해상도 데이터 탐색의 스티치 있도록 오픈 소스 주문품 소프트웨어 도구의 사용을 보여 주었다. 모든 조롱박 세포가 선택적으로 표시되는 L7-GFP 유전자 변형 마우스, 및 임의의 스파 스의 연결 라벨을 특징으로하는 thy1-GFP-M 마우스에서 전체 뇌에서 소뇌 : 마지막으로, 우리는 뇌지도의 일부 예를 보여줍니다.
Introduction
분자 및 세포 기전 뇌 기능에 대한 우리의 이해에 비해, 미세 신경 해부학에 대한 우리의 지식은 초기 단계 1에 여전히 보인다. 사실, 우리는 여전히 뇌 전반에 걸쳐 신경 인 somata 또는 장거리 돌기의 위치의 포괄적 인지도를 부족합니다. 사실, 많은 기술적 노력이 현미경 해상도로 마우스의 두뇌를 재구성하기 위해 헌신하고 있습니다. 수지 내장 샘플의 일련 절편에 따라 광학 방법 칼날 스캐닝 현미경 (KESM)로 2, 마이크로 광학 단면 단층 촬영 (MOST) 3 형광 MOST (fMOST) 4, 서브 마이크론 입체 해상도에게 제공 할 수 있습니다 전체 마우스 뇌의 영상. 그러나, 하나의 샘플의 제조와 촬상에 필요한 전체 시간은 이러한 방법의 실제적 적용을 제한하는 여러 주의 순서이다. 직렬 절편에 따라 또 다른 기술 (그러나 수지 포함시키지 않고), 시리얼 두광자 단층 촬영 (STP) 5, 높은 입체 이미지를 해상도 수 있습니다. 그러나,이 기술은 1 섹션마다 50 ㎛ 5를 수집, 단지 매우 드문 드문 샘플링 전체 마우스의 뇌에서 설명하고 있으며, 우리의 지식 STP는 아직 쥐의 뇌의 전체 샘플링 재건을 생산하지 않았습니다.
고속으로 세 가지 차원에서 전체 표본을 재구성하는 최첨단 광학 방법은 빛 시트 현미경 6입니다. 이 광학 방식에서 샘플을 빛의 얇은 시트를 조명하고, 형광 방출은 조명 평면에 수직 축을 따라 수집됩니다. 이러한 방식에만 포커스에 형광체는 흥분하고 높은 프레임 속도를 보장 넓은 필드 구성의 광학 절편을 달성하는 것이 가능하다. 굴절률 정합 액 7 물 대신에 기반 프로토콜을 취소에 결합 할 때, 빛 시트 현미경에 적용되었습니다전체 마우스 두뇌 8과 같은 거시적 인 표본. 그러나, 획득 된 영상을 흐리게 전체를 추가 – 초점 형광의 여기로 이어지는 빛 시트를 저하도 삭제 표본에 영향을 미치는 빛의 산란을 표본 유도.
만을 선택적 포커스에있는 광자를 수집하기 위해, 우리는 최근에 공 초점 검출 방식 9 빛 시트의 조명을 결합. 공 초점 빛 시트 현미경 (CLSM)에서 포커스 아웃 흩어져 광자가 선형 공간 필터 (슬릿) 사전 탐지 (그림 1)에 의해 거부됩니다. 광 시트 구조의 촛점 작동을 달성하기 위해, 조도는 주사선에 의해 생성 및 검출 경로 레드 스캐닝 시스템은 슬릿의 위치에 여진 주사선의 정지 화상을 작성한다. 셋째 스캐닝 시스템은 카메라 센서에 2 차원 화상을 재구성한다. CLSM 클리어 마우스의 100 % 대비 향상을 준다종래의 광 시트 현미경에 대하여 뇌, 10Hz의 프레임 속도를 유지하면서. CLSM으로는 Z 2 XY μm의 9 μM의 해상도로 전체 마우스 두뇌를 재구성하고, 하나의 형광 표지 된 신경 세포를 식별 할 수있는 충분한 대비가 가능합니다.
이 문서에서 우리는 CLSM와 마우스의 뇌를 재구성하는 실험 파이프 라인에 대해 설명합니다. 알데히드 고정 마우스의 뇌가 과산화없는 테트라 하이드로 퓨란의 등급 일련의 탈수 및 이후 베커 등. 10 클리어 표본에 의해 개발 된 프로토콜에 따라 과산화수소없는 디 벤질 에테르 (그림 2)에서 삭제하는 것은 조심스럽게 흘린에 장착 플레이트와 주문품 공 초점 빛 시트 현미경의 영상 실에 위치. 대안은 삭제 아가 로스 젤의 디스크 (그림에 접착 할 수 있으며, 샘플은 직접 플레이트 (그림 3a)의 선단에 급락하여 장착 할 수 있습니다3B) 또는 삭제 아가로 오스 겔 (그림 3C)으로 만든 비커의 캐비티에 배치. 많은 병렬 인접 스택이 모두 뇌 용적 (그림 4)을 충당하기 위해 취득으로 전체 뇌의 광학 단층 촬영은 다음을 수행합니다. 표본 위치 및 모양의 거친지도를 생성 사전 단층 샘플링은, 촬상에만 시료가 차지하는 부피에서 수행되도록 보장한다. 단층 촬영 스택은 이후 주문품 소프트웨어와 함께 스티치와 다중 해상도 계층 구조 (11)에 저장됩니다. 마우스의 뇌는 결국 프로토 타입 다중 해상도 구글지도처럼 시각화 소프트웨어를 탐색 할 수 있습니다. 이 두 소프트웨어 악기는 오픈 소스 플랫폼 Vaa3D 12 플러그인으로 통합되어 있습니다.
우리는 마침내 좋은 쥐 neuroanatom 공부에 설명 된 실험 파이프 라인의 기능을 설명하기 위해 마우스 두뇌의 대표 이미지를 보여예.
Protocol
Representative Results
Discussion
화학 청소와 결합 CLSM은 형광 프로브, 단백질 중 하나 또는 합성 염료로 표지 전체 마우스 뇌의 신경 해부학을 연구 할 수있는 강력한 도구를 나타냅니다. 초점면 외부에서 방출 된 빛이 물리적 공간 필터에 의해 차단되어 있기 때문에 빛 시트 건축의 전형적인 높은 프레임 속도를 유지하면서, 고 대비 영상은, 두꺼운 표본 수있다.
설명 된 방법을 사용하는 경우를 처리하는 주요 문제는 대비의 극대화이다. 실제로, 가능 신호는 화학 및 광학 요소에 의해 모두 감소된다. 뷰의 화학적 관점에서, 유기 용매를 기반으로 소거 절차는 형광 단백질 및 다른 형광 염료 (7)로부터 방출 급냉있다. 베커 등. 10에서 설명한 바와 같이 용매의 여과, 과산화물을 제거하고, 용매 맑게 조직에서도 형광의 양호한 수준을 유지한다. 게시전체 쥐의 뇌를 처리 할 때 ED 물 기반의 청소 방법 (14)은 적어도 선형 광학 기술과, 형광 효율을 줄일 수 있지만, 가난한 투명성을 초래하지 않습니다.
한편, 순간 고 굴절률 (N ≈ 1.56) 사용한 해법을 맑게 보정 긴 작동 거리를 갖는 상업적인 목적은 없다. 따라서, 샘플이 침지되는 매체와 대물 설계 한 간의 굴절율 부정합이 강한 구면 수차를 일으킨다. 현미경의 해상도를 감소시키는 것 외에도, 이러한 수차는 광이 넓은 영역에 확산되어 있기 때문에, 이미지 세기 및 콘트라스트의 저하가 발생할. 이 문제에 대한 가능한 해결 방법은 적응 광학 (15) 및 / 또는 정적 비구면 보정기의 사용을 포함한다.
의 짧은 이후 이미지 콘트라스트와 강도의 모든 개선은 쉽게, 또한 영상의 속도에 영향을 미치는이미지 당 tegration 시간을 선택할 수 있습니다. 순간 CLSM은 100 밀리 초 (9)의 카메라의 노출 시간에 따라, 대략 106 μm의 3 / 초의 촬상 속도를 수득 할 수있다. 이 속도로 샘플 크기에 따라 1-3 일에서 이미지에 전체 마우스의 두뇌를 사용합니다. 이미지 품질에 큰 저하는 대부분 빛 때문에 시트 조명 (6)의 고유 저 광표백 같은 긴 영상 세션에 걸쳐 관찰되지 않지만, 오랜 시간이 하나의 마우스의 두뇌가 실제로 CLSM의 적용 가능성을 줄일 수있는 이미지를 필요로했다. 검출을위한 고속 카메라를 이용하여 결합 된 시스템 효율이 10 배 증가는, 기재된 프로토콜의 일상적인 사용을 허용하는, 몇 시간에 촬상 시간을 줄이는 것이다.
모든 상기의 제한에도 불구하고, 이하 마이크론 규모의 해상도로 전체 마우스 두뇌를 재구성하기 위해 조직의 허가 화학 청산에 결합 CLSM 영상주. 전체 뇌 영상에 대한 다른 광학 방법은 CLSM보다 더 높은 해상도를 여유가 있지만, 더 이상 준비 및 / 또는 영상 시간 2 ~ 4의 가격, 또는 스파 스 Z 샘플링 5.
이 문서에서 설명하는 방법은 형광 표지에 대해 서로 다른 전략과 함께 이용 될 수있다 : 형질 전환 동물 등 선택의 연결 부분 집합, 바이러스 성 형질 전환, 뇌실질 내 염료 주입, 형광 단백질을 표현 실제로, 동물 희생을 앞의 모든 염색 전략 CLSM과 호환 . , 염색의 그런 종류가 가까운 미래에 가능하면 어쨌든, CLSM으로 재구성 할 수있는 표본의 수는 훨씬 더 될 것입니다, 사실, 전체 마우스 두뇌의 사후 형광 라벨은 지금까지 입증되지 않은 잠재적으로 인간 뇌 조직 등.
결론적으로, 광 시트 공 초점 현미경은 TIS와 병용고소 개간 및 다중 해상도의 데이터 관리 연구원은 대부분의 실험실의 손에 잘있다 기술적 노력, 마이크론 규모의 해상도로 거시적 인 표본을 재구성하고 분석 할 수 있습니다. CLSM의 잠재적 인 응용 프로그램은 신경 과학에 국한되지 물론이지만, 16, 17 및 작은 동물 (18)의 해부학 배아로, 빛 시트 현미경은 이미 사용 된 모든 연구 분야에 걸쳐있다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이러한 결과로 이어지는 연구는 N 부여 계약에 따라 유럽 연합의 제 7 차 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)로부터 자금을 받았다. 228334과 241526. 이 연구 프로젝트는 인간 프론티어 과학 프로그램의 연구 보조금 (RGP0027/2009)에서 지원하고있다 플래그십 프로젝트 Nanomax의 프레임 워크의 교육, 대학과 연구 이탈리아 교육부와의 틀에서 건강 이탈리아 교육부 "줄기 세포는 제안에 대해 전화". 이 연구는 "접대 카사 디 Risparmio 디 피렌체"에서 지원 ICON 재단의 연구 활동의 프레임 워크에서 수행되었습니다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Sigma-Aldrich | P4417_100TAB | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Peroxide-free Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 186562 | |
| Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| Butylated hydroxytoluene | Sigma-Aldrich | W218405 | |
| Agarose Type III-A, High EEO | Sigma-Aldrich | A9793 | |
| Acrylic glue | Bostik | D2498 | |
| Vaa3D software | open source | freely downloadable from http://www.vaa3d.org/ |
References
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