Измерение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) является золотым стандартом для оценки функции почек. Здесь мы описываем высокой пропускной метод, который позволяет определить СКФ в сознании мышей с помощью одной инъекции ударной дозы, определение изотиоцианат флуоресцеина (FITC) инулина в плазме и расчета СКФ по двухфазной экспоненциальной модели распада.
Измерение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) является золотым стандартом в оценке функции почек. В настоящее время исследователи определения СКФ путем измерения уровня эндогенного креатинина биомаркера или экзогенно прикладной радиоактивного меченого инулин (3 H или 14 C). Креатинин имеет существенный недостаток, что проксимальных канальцев счетов секреции в течение ~ 50% от общего числа почечной экскреции креатинина и поэтому креатинина не является надежным маркером СКФ. В зависимости от эксперимента, выполненного, инулин зазор может быть определена путем внутривенной инъекции ударной дозы одного или непрерывной инфузии (внутривенно или осмотического мининасоса). Оба способа требуют сбора плазмы или плазме и моче соответственно. Другие недостатки радиоактивного меченого инулин включать использование изотопов, требует много времени хирургической подготовки животных и требование терминал эксперимента. Здесь мы описываем способ, который использует одну инъекцию ударной дозыизотиоцианат флуоресцеина-(FITC), меченого инулин и измерение его флуоресценции в течение 1-2 мкл разведенной плазмы. Применяя двухкамерные модели с 8 крови коллекций на мышь, можно измерить СКФ до 24 мышей в день с помощью специального рабочего процесса протокола. Этот метод требует только краткого изофлурана наркозом, и всем образцы крови собирают в не сдержан и просыпаются мыши. Другое преимущество состоит в том, что можно следовать мышей в течение нескольких месяцев и лечения (т.е. делает парные эксперименты с диетических изменений или лекарственное средство приложений). Мы надеемся, что эта методика измерения СКФ является полезным для других исследователей изучения функции почек и мышь заменят менее точные методы оценки функции почек, такие как плазменные креатинина и азота мочевины крови.
Скорость образования плазмы ультрафильтрате через клубочки стала основой для оценки функции почек (скорость клубочковой фильтрации, СКФ). Идеальным маркером для определения СКФ следует свободно фильтруется, не секретируется или поглощаться, а не метаболизируется. Такое поведение было обнаружено, что касается инулина и клиренс инулина стала золотым стандартом для определения СКФ 3. В то время как оформление креатинина широко используется в качестве меры СКФ у людей и животных, креатинин не отвечают требованиям идеального маркером СКФ. Около 10 – 40% от клиренса креатинина в организме человека является следствием активной канальцевой секреции 1, 11, и почечную секрецию креатинина также видное место в мышах и крысах 4, 7, 9, 22. Нарушение функции почек как известно, увеличивает канальцевую секрецию креатинина что ограничивает его значение как маркер СКФ 1, 2. Ранее мы показали, что органические изоформы Transporter аниона3 (OAT3) способствует мышиный почечной секреции креатинина 22. Тем не менее, инулин зазор обычно требует использования радиоактивных меченых инулина (3 H или 14 C). Радиоактивных определения инулин может быть использован как в наркоз и сознательный мышей, но таит в себе многочисленные недостатки правил техники безопасности и строгой проблемы обработки присущи с использованием радиоактивных изотопов. В том же ключе, хирургическая подготовка зазор для определения СКФ занимает много времени, а также терминал в природе. В 1999 году Лоренц и соавт. 12 введен FITC-инулина в качестве маркера одного нефрона СКФ у анестезированных мышах. Пять лет спустя Ци и др.. 15 определяется целой почки СКФ в сознательном мышей с помощью FITC-инулин. Альтернативные протоколы в настоящее время используют FITC-инулин как экзогенный маркера для измерения СКФ в сознательном и наркозом мышей. Эти протоколы сохранить чувствительность радиоактивных инулина с помощью флуоресценции Детективна обход и недостатки работы с радиоактивными помечены маркером. FITC-инулин анализа была модифицирована другими 7, 8 и нам 22, 23, чтобы воспользоваться возможностью микрообъеме NanoDrop 3300 fluorospectrometer. Это позволяет уменьшить общий объем образца, необходимый для <100 мкл крови в СКФ измерения.
С помощью метода и высокая пропускная способность протокола представленная в данном издании, мы демонстрируем возможность измерения СКФ в 24 сознательным мышей в сутки. Эта техника может быть полезна другим исследователям изучение мышиной СКФ и мы надеемся, что он заменит менее точные методы, показатели функции почек, такие как креатинина и азота мочевины крови.
В данной работе описан способ определения СКФ в сознании мышей одной болюсной инъекции и анализ флуоресценции в 8 проб крови на две фазы экспоненциального затухания. Измерение СКФ в 1 мыши занимает 75 мин. С помощью специального блок-схему, можно измерить скорость клубочковой фильтрации из 6 мышей в 130 мин. Вполне возможно, повторить это блок-схема протокола до 4 раз в день и измерить СКФ у 24 мышей. Мы модифицировали этот метод так, что можно собрать кровь из небольшого надреза хвоста, а не прокол хвостовую вену, которая является быстрым и легким для исследователей для выполнения по сравнению с хвостом прокол вены. С помощью 10 мкл гематокрита капилляров и 1:10, можно уменьшить общее количество крови, необходимое для <100 мкл. Наконец, флуоресценцию измеряли с использованием NanoDrop 3300 fluorospectrometer, которая позволяет определять флуоресценцию в 1-2 мкл разбавленного образца. Этот метод даст заинтересованным investigatoРА истинное значение СКФ. В противоположность этому, креатинина измерений на мышах ряд недостатков в том числе "слепой креатинина диапазона" и трудности, связанные с специфичностью и чувствительностью определения. "Слепые креатинина диапазона" ограничивает его функции в качестве маркера для СКФ потому креатинина сыворотки остается в пределах нормы до 50% функции почек не потеряны 19. Так некоторые исследователи используют генетически модифицированных мышей в своих исследованиях для изучения почечной физиологии и патофизиологии, это несет в себе следующую задачу: если предположить, нокаут мыши ген X будет иметь значительно более низкой СКФ (на 40%) по сравнению с диким типом мышь, простой перебор, сравнивая креатинина плазмы не обнаружить эту разницу. Потребность в хорошем точный метод определения СКФ становится более важным, чем меньше различий в СКФ стали.
Мыши имеют высокие концентрации некреатининовых chromagens в плазме и моче, которые мешают коммерческидоступных анализов креатинина. Как следствие, анализы, основанные на щелочной пикратом Яффе реакции завышение концентрации креатинина в плазме по сравнению с высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определение 6, 13. Еще одним ограничением является то, что сывороточный креатинин ниже пределов обнаружения нескольких коммерчески доступных анализов по сравнению с определением ВЭЖХ. Однако с помощью ферментативных реакций исследователи смогли определить креатинина в плазме на 10 мышей, 22.
СКФ в аналогичном диапазоне были обнаружены в сознании мышей с использованием сопоставимых одной болюсной инъекции способа, а также мочевой FITC-инулин зазор 14. В отличие от своих протоколов, наш протокол, используя хвост СНиП не требует специальных мер предосторожности для сохранения целостности судна по сравнению с хвостовой вены или подкожной прокола вены. Для мочевого / плазменный основанный FITC-клиренс инулина необходимо хирургическим путем имплантировать два осмотического миnipumps. Два насоса, которые необходимы для достижения достаточно высокой стационарной плазмы FITC-инулин концентрациях, которые четко отличаться от фона. Это также требует использования метаболические клетки на полную и время образец мочи. Клетки должны быть промыты для учета потери 25-37% от FITC-инулин, который в противном случае происходит без промывки.
Подводные камни использования этого FITC-инулин метода ограничены. Следователи должны быть осведомлены о следующем: (I), уверяют, что нет пузырьков воздуха в шприце для инъекций из FITC-решения, (II) полный ретробульбарная инъекции должна быть достигнута, так как количество вводят определяется расчетным СКФ и ( III) мышей, скорее всего, мочу в течение 75 мин эксперимент СКФ, так что избежать загрязнения пробы крови с мочой, которые имеют очень высокую FITC-инулин концентрации, как следствие способность концентрации почек.
Общие преимущества Oе это FITC-инулин способ включает следующее: (а) они нерадиоактивные техники (II) можно повторить измерения несколько раз в той же мыши, (III), анализ может быть выполнен в сознании мышей ( IV) не сбор мочи не требуется, и (V) с высокой пропускной опции могут быть использованы. Недостатки для одного болюсной инъекции включают необходимость диализа FITC-инулин, которые могут быть преодолены с помощью лучшего FITC-маркер, FITC-sinistrin, которая доступна в настоящее время и может быть измерено чрескожно с помощью специального миниатюрного устройства 18. Даже если СКФ измеряется, это невозможно измерить дробным выделения жидкости или ионов с этим методом.
Взятые вместе, этот метод обеспечивает возможность высокой пропускной способ измерения СКФ в сознании мышей. Таким образом, эта техника может представлять интерес для других исследователей, которые заинтересованы в определении функции почек у мышей.
The authors have nothing to disclose.
Я благодарю доктора Джессики Домингес RIEG за критическое прочтение этой рукописи. Работа выполнена при поддержке Американской ассоциации сердца (Ученый гранта на развитие 10SDG2610034), Carl W. Готшалка Исследовательский грант Американского общества нефрологии, Национальный институт диабета, желудочно-кишечных и почечных заболеваний О'Брайен Центра исследований Острая повреждение почек ( P30DK079337) и Департамента по делам ветеранов.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
FITC-inulin | Sigma-Aldrich | F3272 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7706 | |
Isoflurane | Webster Veterinary | 78366551 | |
Dialysis membrane (MWCO 1000) | Spectrum Laboratories | 132636 | |
Membrane closure | Spectrum Laboratories | 132736 | |
80 μl Hematocrit capillaries | Drummond Scientific | 22362566 | |
Hematocrit centrifuge | IEC | Micro-MB | |
10 μl Na+-Heparin minicaps | Hirschmann | 9000210 | |
Syringe (100 μl) | Hamilton | 80601 | |
Fluorospectrometer | Thermo-Fisher Scientific | NanoDrop 3300 | |
Filter (0.22 μm) | Spectrum Laboratories | 880-26464-UE | |
Sealant | Châ-seal | 510 | |
Needles (G26 ½ and G30 ½) | Becton Dickinson | 305111 & 305106 |