Glomerüler filtrasyon hızı (GFR) ölçümü böbrek fonksiyonunun değerlendirilmesi için altın standarttır. Burada iki aşamalı bir üstel bozulma modeli ile plazma ve GFR hesaplanmasında tek bolus enjeksiyon, floresein izotiyosiyanat belirlenmesi (FITC)-inulin kullanarak bilinçli farelerde GFR belirlenmesinde sağlayan yüksek verimli yöntem açıklanmaktadır.
Glomerüler filtrasyon hızı (GFR) ölçümü böbrek fonksiyonu değerlendirmede altın standarttır. Şu anda, araştırmacılar endojen biyolojik kreatinin veya eksojen uygulanan radyoaktif etiketli inulin (3H veya 14 C) düzeyi ölçülerek GFR belirler. Kreatinin ~ 50 toplam renal kreatinin atılımının% ve bu nedenle kreatinin için proksimal tübüler sekresyon hesapları güvenilir bir GFH belirteç olmadığı önemli dezavantajı vardır. Gerçekleştirilen deney ile ilgili olarak, inülin klirensi intravenöz, bolus enjeksiyonu ya da sürekli infüzyon (damar içine ya da ozmotik mini-pompa) tarafından tespit edilebilir. Her iki yaklaşım sırasıyla, plazma veya plazma ve idrar toplama gerektirir. Radyoaktif etiketli inulin başka dezavantajları izotoplarının kullanımı, hayvanların zaman alıcı bir cerrahi hazırlanması ve bir terminal deney gereksinimi bulunmaktadır. Burada, tek bir bolus enjeksiyon kullanan bir yöntem tariffloresein izotiosiyanat-(FITC) işaretli inulin ve seyreltilmiş plazma 1-2 ul kendi floresans ölçümü. Fare başına 8 kan koleksiyonları ile, iki bölme modeli uygulayarak, özel bir iş akışı protokolü kullanarak günde 24 fareler için GFR ölçmek mümkündür. Bu yöntem, yalnızca sigara ölçülü ve uyanık fare toplanan tüm kan örnekleri ile kısa izofluran anestezi gerektirir. Başka bir avantajı da birkaç ay ve tedaviler (örneğin diyet değişikliği ya da ilaç uygulamaları ile eşleştirilmiş deneyler yaparak) bir süre boyunca farenin takip etmek mümkün olmasıdır. Biz ölçüm GFR bu tekniği fare böbrek fonksiyonu okuyan diğer araştırmacılar için yararlıdır ve bu plazma kreatinin ve kan üre azot gibi böbrek fonksiyonu, tahmin daha az doğru yöntemlerinin yerini umuyoruz.
Glomerulus de plazma ultrafiltratında oluşum oranı renal fonksiyon (glomerüler filtrasyon hızı, GFR) değerlendirmek için temel haline gelmiştir. GFH belirlemek için ideal bir işaretleyici serbestçe, filtre salgılanan veya emilir ne ve metabolize olmamalıdır. Böyle bir davranış inulin için doğru bulunmuştur ve inülin klirensi GFR 3 belirlenmesi için altın standart haline gelmiştir. Kreatinin klirensi yaygın olarak, insanlarda ve hayvanlarda GFR bir ölçüsü olarak kullanılır ise, kreatinin ideal GFR marker gereklilikleri yerine getirmemektedir. Yaklaşık 10 – insanlarda kreatinin klirensi% 40 aktif tübüler sekresyon 1, 11 sonucudur, ve kreatinin böbrek salgısı da fare ve sıçan 4, 7, 9, 22 belirgindir. Böbrek fonksiyon bozukluğu GFR 1, 2 bir belirleyicisi olarak değerinin sınırlar kreatinin tübüler sekresyon arttırdığı bilinmektedir. Daha önce organik anyon taşıyıcı izoformu göstermiştir3 (OAT3) faregiller böbrek kreatinin sekresyon 22 katkıda bulunur. Bununla birlikte, tipik olarak inülin klirensi radyoaktif etiketli inulin (3 H ya da 14 ° C) kullanımını gerektirir. Inulin radyoaktif belirlenmesi anestezi ve bilinçli hem farelerde kullanılan, ancak çok sayıda güvenlik yönetmeliklerine ve radyoaktif izotopların kullanımı ile doğal katı işleme konularda dezavantajları barındırıyor olabilir. Bu doğrultuda, GFH belirlenmesi için cerrahi boşluk hazırlıkları zaman alıcı hem de doğada terminali bulunmaktadır. 1999 yılında Lorenz ve arkadaşları. 12 anestezi farelerde tek nefron GFR bir göstergesi olarak FITC inulin tanıttı. Beş yıl sonra Qi ve ark. 15 FITC inulin kullanarak bilinçli farelerde tüm böbrek GFR belirlenir. Alternatif protokolleri artık bilinçli ve anestezi farelerde GFR ölçmek için dışsal belirteç olarak FITC inulin kullanıyorsunuz. Bu protokoller, floresan detecti kullanılarak radyoaktif inulin duyarlılığı korumakve bir radyoaktif etiketli işaretleyici ile çalışma dezavantajları engellemeyi. FITC inulin testi NanoDrop 3300 fluorospectrometer en microvolume yeteneği yararlanmak diğerleri 7, 8 ve bize 22, 23 tarafından güncellenmiştir. Bu GFH ölçüm başına <100 ul kan için gerekli olan toplam örnek hacmi azaltarak sağlar.
Yöntem ve bu yayında sağlanan yüksek verimlilik protokolü ile, biz günde 24 bilinçli fareler için ölçüm GFR fizibilite göstermektedir. Bu teknik fare GFH okuyan diğer araştırmacılar için yararlı olabilir ve biz bu tür kreatinin ve kan üre azotu olarak böbrek fonksiyonu için endeksleri, daha az doğru yöntemlerinin yerini umuyoruz.
Bu çalışma, iki fazlı üssel bir azalma 8 kan örneklerinde floresans tek bolus enjeksiyonu ve analiz bilinçli farelerde GFR belirlenmesi için bir yöntem açıklanır. 1 fare bir GFH ölçümü 75 dakika sürer. Özel bir akış şeması kullanılarak, 130 dakika içinde 6 farelerinin GFR ölçmek mümkündür. Bu kadar günde 4 kez bu akış şeması protokolü tekrar ve 24 farelerde GFR ölçmek mümkündür. Daha hızlı ve araştırmacılar kuyruk ven ponksiyon göre gerçekleştirmek için daha kolay olan küçük bir kuyruk kelepir yerine kuyruk ven delinme, kan toplamak mümkün olduğunu bu nedenle bu yöntem değiştirilmiş. 10 ul hematokrit kapiller ve 1:10 seyreltme kullanılarak, <100 ul için gerekli kan toplam miktarını azaltmak mümkündür. Son olarak, floresan seyreltilmiş numunenin 1-2 ul floresan belirlenmesine izin verir NanoDrop 3300 fluorospectrometer kullanılarak ölçülür. Bu yöntem, ilgili investigato verecekra gerçek GFR değeri. Buna karşılık, farelerde kreatinin ölçümleri "kreatinin kör aralığı" ve belirli ve hassas belirlenmesi ile ilgili zorluklar dahil olmak üzere birçok zayıf yönleri vardır. Böbrek fonksiyonlarının 50% 19 kaybolana kadar serum kreatinin normal sınırlar içinde kaldığından "kreatinin kör aralığı" GFH için bir belirteç olarak işlevini sınırlar. Gen X bir nakavt fare varsayarak bir yabani tip fare ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük GFH (% 40), bir olurdu: bazı araştırmacılar böbrek fizyolojisi ve patofizyolojisi çalışma araştırmalarında genetik olarak değiştirilmiş fareler kullanmak için, bu aşağıdaki sorun taşımaktadır plazma kreatinin karşılaştırarak basit tarama bu fark tespit olmaz. GFR belirlenmesi iyi bir doğru bir yöntem için ihtiyaç GFR'de farklılıklar çok daha küçük daha kritik hale gelmektedir.
Fareler ticari müdahale onların plazma ve idrarda olmayan kreatinin chromagens yüksek konsantrasyonlardaMevcut kreatinin ölçülür. Bunun bir sonucu olarak, plazmadaki alkali pikrat Jaffe reaksiyonu fazla tahmin kreatinin konsantrasyonu dayalı tahliller, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) tayini 6, 13 ile karşılaştırıldığında. Başka bir sınırlama serum kreatinin HPLC belirlenmesi göre aşağıda çeşitli ticari testlerin tespit limitleri olduğunu. Ancak, enzimatik reaksiyonlar araştırmacılar kullanarak fareler 10, 22 plazma kreatinin belirlemek başardık.
Benzer bir dizi GFR benzer bir tek bolus enjeksiyon yöntemi hem de idrar FITC inülin açıklık 14 kullanılarak bilinçli bir farenin bulundu. Kendi protokolünün aksine, kuyruk kelepir kullanarak protokol özel önlem kuyruk ven veya safen ven delinme göre geminin bütünlüğünü korumak için gerektirmez. FITC inulin tabanlı idrar / plazma klirensi için cerrahi iki osmotik mi implant gereklidirnipumps. Iki pompa arka plan açıkça ayırt edilebilir yeterince yüksek sabit-durum plazma FITC inulin konsantrasyonları elde etmek için gereklidir. Bu aynı zamanda, bir tam ve idrar toplanması için metabolik kafesler arasında kullanımını gerektirir. Kafesler aksi durulama olmadan meydana FITC inulin 25-37% arasında bir kayıp hesaba durulanması gereken.
Bu FITC inülin yöntemi kullanmanın tuzaklar sınırlıdır. Müfettişler şu farkında olmalıdır: (i) FITC-çözüm enjeksiyon için kullanılan şırınga içinde hava kabarcığı olduğunu temin ederim, (ii) tam retrobulber enjeksiyon enjekte miktarı hesaplanan GFR belirler çünkü elde, ve olmalıdır ( iii) fareler, böylece böbrekler konsantrasyon yeteneğinin bir sonucu olarak, çok yüksek bir FITC inülin konsantrasyonuna sahip olacaktır idrar, kan örneği ile karışmasını 75 dakika GFR deney sırasında muhtemelen idrar kaçınır.
Genel avantajları oF Bu FITC inülin yöntemi aşağıdakileri içerir: (i) (ii) (III) 'tahlilinde, bilinçli farelerde yapılabilir, aynı fare ölçümler birden çok kez tekrarlamak mümkündür, radyoaktif olmayan bir tekniktir ( iv) idrar toplama gereklidir, ve (v) Yüksek verimli bir seçenek kullanılabilir. Tek bir bolus enjeksiyon için dezavantajlar artık kullanılabilir ve özel bir minyatür cihaz 18 kullanılarak transkütan ölçülebilir daha iyi bir FITC işaretleyici, FITC sinistrin kullanılarak aşılabilir FITC inulin diyaliz ihtiyacını içerir. GFR ölçülür olsa da, bu yöntem ile akışkan veya iyonların fraksiyonel idrar ölçülmesi mümkün değildir.
Birlikte ele alındığında, bu yöntem, bilinçli farelerde GFR ölçmek için yüksek verimli bir yöntemin uygulanabilirliğini içerir. Bu nedenle, bu teknik farelerde böbrek fonksiyon belirlenmesinde ilgilenen diğer araştırmacılar için ilgi çekici olabilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu yazının eleştirel okuma Dr Jessica Dominguez RIEG teşekkür ederim. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği (Scientist Kalkınma Hibe 10SDG2610034), Nefroloji American Society bir Carl W. Gottschalk Araştırma Bursu, Diyabet Ulusal Enstitüsü ve Akut Böbrek Yaralanma Araştırma Sindirim ve Böbrek Hastalıkları O'Brien Merkezi (tarafından desteklenmiştir P30DK079337), ve Gazi İşleri Bakanlığı.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
FITC-inulin | Sigma-Aldrich | F3272 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7706 | |
Isoflurane | Webster Veterinary | 78366551 | |
Dialysis membrane (MWCO 1000) | Spectrum Laboratories | 132636 | |
Membrane closure | Spectrum Laboratories | 132736 | |
80 μl Hematocrit capillaries | Drummond Scientific | 22362566 | |
Hematocrit centrifuge | IEC | Micro-MB | |
10 μl Na+-Heparin minicaps | Hirschmann | 9000210 | |
Syringe (100 μl) | Hamilton | 80601 | |
Fluorospectrometer | Thermo-Fisher Scientific | NanoDrop 3300 | |
Filter (0.22 μm) | Spectrum Laboratories | 880-26464-UE | |
Sealant | Châ-seal | 510 | |
Needles (G26 ½ and G30 ½) | Becton Dickinson | 305111 & 305106 |