Messung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) ist der Goldstandard für die Beurteilung der Nierenfunktion. Hier beschreiben wir ein Verfahren mit hohem Durchsatz, die die Bestimmung der GFR bei wachen Mäusen unter Verwendung einer einzigen Bolusinjektion Bestimmung Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Inulin in Plasma und Berechnung der GFR durch eine Zwei-Phasen-exponentiellen Modell ermöglicht.
Die Messung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) ist der Goldstandard in der Nierenfunktion Einschätzung. Zurzeit bestimmen Ermittler GFR durch Messen des Pegels des endogenen Biomarker Kreatinin oder exogen applizierten radioaktiv markierten Inulin (3 H oder 14 C). Kreatinin hat den wesentlichen Nachteil, dass proximalen tubulären Sekretion Konten für ~ 50% der gesamten Kreatinin-Ausscheidung und damit Kreatinin kein verlässlicher Marker GFR. Je nach Experiment durchgeführt, kann Inulin-Clearance durch eine intravenöse einzigen Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion (intravenös oder osmotische Minipumpe) bestimmt werden. Beide Ansätze erfordern die Sammlung von Plasma oder Plasma und Urin sind. Andere Nachteile von radioaktiv markierten Inulin enthalten sind die Nutzung von Isotopen, zeitaufwendig chirurgische Vorbereitung der Tiere, und die Forderung nach einer Terminal Experiment. Hier beschreiben wir eine Methode, die einen einzigen Bolus-Injektion von verwendetFluoreszeinisothiocyanat-(FITC) markiert Inulin und die Messung der Fluoreszenz in 1-2 ul verdünntem Plasma. Durch die Anwendung eines Zwei-Kammer-Modell mit 8 Blutsammlungen pro Maus, ist es möglich, in GFR messen bis zu 24 Mäuse pro Tag mit einem speziellen Workflow-Protokoll. Diese Methode erfordert nur kurze Isofluran-Narkose mit allen Blutproben in einer nicht-zurückhaltend und wach Maus gesammelt. Ein weiterer Vorteil ist, dass es möglich ist, Mäusen über einen Zeitraum von mehreren Monaten und Behandlungen (dh tun gepaart Experimente mit Veränderungen in der Ernährung oder medikamentöse Anwendungen) folgen. Wir hoffen, dass diese Technik von Mess-GFR nützlich für andere Forscher studieren Maus Nierenfunktion und weniger genaue Methoden zur Schätzung der Nierenfunktion, wie Plasma-Kreatinin und Blut-Harnstoff-Stickstoff zu ersetzen.
Die Geschwindigkeit der Bildung von Plasma-Ultrafiltrat am Glomerulus hat sich die Grundlage für die Beurteilung der Nierenfunktion (glomeruläre Filtrationsrate, GFR). Der ideale Marker GFR bestimmen sollte frei gefiltert werden, weder sezerniert oder resorbiert und nicht metabolisiert. Ein solches Verhalten wurde festgestellt, dass für Inulin wahr, und Inulin-Clearance hat sich eine Gold-Standard zur Bestimmung der GFR 3. Während die Clearance von Kreatinin wird weitgehend als ein Maß der GFR bei Menschen und Tieren eingesetzt werden, stellt Kreatinin erfüllen nicht die Anforderungen an ein ideales GFR-Marker. Rund 10 – 40% der Kreatinin-Clearance beim Menschen ist die Folge der aktive tubuläre Sekretion 1, 11, und die renale Sekretion von Kreatinin ist auch prominent in Mäusen und Ratten 4, 7, 9, 22. Nierenfunktionsstörung ist bekannt, dass die röhrenförmige Sekretion von Kreatinin, was deren Wert begrenzt als Marker der GFR 1, 2 erhöhen. Wir haben bereits, dass organisches Anion Transporter Isoform gezeigt3 (OAT3) trägt zur Maus Kreatinin-Sekretion 22. Jedoch Inulin-Clearance erfordert typischerweise die Verwendung von radioaktiv markierten Inulin (3 H oder 14 C). Die radioaktive Bestimmung von Inulin kann sowohl betäubt und wachen Mäusen verwendet werden, sondern birgt den Nachteil zahlreicher Sicherheitsvorschriften und Handhabung strenge Fragen bei der Verwendung radioaktiver Isotope. Entlang dieser Linien, sind chirurgische Clearance Vorbereitungen zur Bestimmung der GFR zeitaufwendig sowie Terminal in der Natur. 1999 Lorenz et al. 12 eingeführt FITC-Inulin als Marker der einzige Nephron GFR bei narkotisierten Mäusen. Fünf Jahre später Qi et al. Bestimmt ganze 15 GFR in wachen Mäusen mit FITC-Inulin. Alternative Protokolle sind jetzt mit FITC-Inulin als exogene Marker GFR in bewusste und narkotisierten Mäusen messen. Diese Protokolle behalten die Empfindlichkeit des radioaktiven Inulin mit Fluoreszenz DETECTIauf und umgeht die Nachteile der Zusammenarbeit mit einem radioaktiv markierten Marker. Die FITC-Inulin Assay wurde von anderen 7, 8 und uns 22, 23 modifiziert werden, um die Vorteile der Mikrovolumen Fähigkeit des NanoDrop 3300 Fluorospektrometer nehmen. Dies ermöglicht die Verringerung der gesamten Probenmenge benötigt, um <100 ul Blut pro GFR-Messung.
Mit dem Verfahren und Hochdurchsatz-Protokoll in dieser Veröffentlichung zeigen wir die Machbarkeit von Mess-GFR in bis zu 24 Mäuse pro Tag bewusst. Diese Technik könnte nützlich sein, um andere Forscher studieren Maus GFR und wir hoffen, dass es weniger genaue Methoden als Indizes für die Nierenfunktion, wie Kreatinin und Blut-Harnstoff-Stickstoff zu ersetzen.
Die vorliegende Studie beschreibt eine Technik zur Bestimmung der GFR in wachen Mäusen durch Single-Bolus-Injektion und Analyse von Fluoreszenz in 8 Blutproben mittels Zweiphasen-exponentiellen Abfall. Eine GFR Messung in 1 Maus dauert 75 min. Durch Verwendung eines speziellen Flussdiagramm, ist es möglich, die GFR von 6 Mäusen in 130 min zu messen. Es ist möglich, dieses Flussdiagramm-Protokoll bis zu 4 Mal pro Tag wiederholen und messen GFR in 24 Mäuse. Wir modifizierten diese Methode, so dass es möglich ist, Blut aus einem kleinen Schwanz snip anstatt Schwanzvene Punktion, die schneller und einfacher für Ermittler im Vergleich zu Schwanzvene Punktion durchzuführen sammeln. Durch die Verwendung von 10 ul Hämatokritkapillaren und einer 1:10-Verdünnung, ist es möglich, die gesamte Menge des Blutes benötigt, um <100 ul zu reduzieren. Schließlich wird die Fluoreszenz gemessen mit einem NanoDrop 3300 Fluorospektrometer, die Bestimmung der Fluoreszenz ermöglicht in 1-2 ul verdünnten Probe. Diese Methode wird dem interessierten investigatora wahre GFR Wert. Im Gegensatz dazu haben Kreatinin-Messungen bei Mäusen mehrere Schwachstellen, darunter "Kreatinin-blinden Bereich" und Schwierigkeiten im Zusammenhang mit spezifischen und sensitiven Bestimmung. Die "Kreatinin-blinden Bereich" schränkt seine Funktion als Marker für GFR weil Serum-Kreatinin bleibt im normalen Bereich bis 50% der Nierenfunktion 19 verloren. Da mehrere Forscher genetisch veränderte Mäuse in ihrer Forschung zu Nieren-Physiologie und Pathophysiologie studieren nutzen, trägt dies folgendes Problem: Annahme einer Knockout-Maus von Gen-X würde eine deutlich geringere GFR (um 40%) im Vergleich zu einer Wildtyp-Maus, eine haben einfache Screening durch Vergleich Plasma-Kreatinin würde nicht erkennen diesen Unterschied. Die Notwendigkeit für eine gute genaue Methode zur Bestimmung GFR wird immer kritischer, je kleiner die Unterschiede in GFR geworden.
Mäuse haben hohe Konzentrationen von nicht-Kreatinin Chromagene in ihrem Plasma und Urin, die mit kommerziell störenverfügbar Kreatinin-Assays. Als Folge Assays, die auf der alkalischen picrate Jaffé Reaktion Überschätzung Kreatinin-Konzentration im Plasma bezogen sind mit Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Bestimmung 6, 13 verglichen. Eine weitere Einschränkung ist, dass Serum-Kreatinin ist unterhalb der Nachweisgrenze von mehreren kommerziell erhältlichen Assays im Vergleich zu HPLC-Bestimmung. Durch Verwendung von enzymatischen Reaktionen Ermittler konnten Plasma Kreatinin in Mäusen 10, 22 zu bestimmen.
GFR in einem ähnlichen Bereich wurden in wachen Mäusen mit einem vergleichbaren Single-Bolus-Injektion Verfahren sowie Harn-FITC-Inulin-Clearance 14 gefunden. Im Gegensatz zu ihr Protokoll, unser Protokoll mit Schwanz snip erfordern keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen, um das Gefäß Integrität gegenüber Schwanzvene oder Vena saphena Punktion zu bewahren. Für den Harn / Plasma basierend FITC-Inulin-Clearance ist es notwendig, chirurgisch Implantat zwei osmotischen minipumps. Zwei Pumpen sind notwendig, um hoch genug Steady-State-Plasmaspiegel FITC-Inulin-Konzentrationen, die deutlich vom Hintergrund zu erzielen. Dies erfordert auch die Nutzung der metabolischen Käfigen für eine vollständige und zeitlich Urinsammlung. Die Käfige müssen zur Rechenschaft für einen Verlust von 25-37% des FITC-Inulin, die sonst tritt ohne Spülung gespült werden.
Die Fallstricke der Verwendung dieses FITC-Inulin Verfahren sind begrenzt. Die Ermittler sollten Sie Folgendes beachten: (i) zu gewährleisten, dass es keine Luftblasen in der Spritze für die Injektion des FITC-Lösung verwendet wird, muss (ii) vollständige retrobulbären Injektion erreicht werden, weil die Menge eingespritzt bestimmt die GFR berechnet werden, und ( iii) Mäusen wird höchstwahrscheinlich urinieren während der 75 min GFR Experiment, so dass eine Verschmutzung Blutproben mit Urin, die eine sehr hohe FITC-Inulin Konzentration als Folge der Nieren Konzentrationsfähigkeit haben.
Allgemeine Vorteile of diese FITC-Inulin Verfahren umfassen die folgenden: (i) es ist ein nicht-radioaktives Technik, (ii) es möglich ist, wiederholt Messungen mehrfach in der gleichen Maus, (iii) kann der Assay in wachen Mäusen durchgeführt werden ( iv) keine Urinsammlung erforderlich ist, und (v) eine Hochdurchsatz-Option verwendet werden. Nachteile für die einzelnen Bolus-Injektion sind die Notwendigkeit zur Dialyse von FITC-Inulin, das durch die Verwendung eines besser FITC-Marker, FITC-Sinistrin, die jetzt zur Verfügung steht und kann transkutan gemessen werden unter Verwendung eines speziellen miniaturisierten 18 überwunden werden können. Obwohl GFR gemessen wird, ist es nicht möglich, fraktionierte Ausscheidungen von Flüssigkeit oder Ionen mit dieser Methode zu messen.
Zusammengenommen bietet dieses Verfahren die Machbarkeit eines High-Throughput-Verfahren zur Messung der GFR in wachen Mäusen. Daher könnte diese Technik von Interesse für andere Forscher, die daran interessiert bei der Bestimmung der Nierenfunktion bei Mäusen sein.
The authors have nothing to disclose.
Ich danke Dr. Jessica Dominguez Rieg für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der American Heart Association (Scientist Development Grant 10SDG2610034), einem Carl W. Gottschalk Forschungsstipendium der amerikanischen Gesellschaft für Nephrologie, der National Institute of Diabetes and Digestive und Nierenkrankheiten O'Brien Center for Acute Kidney Injury Forschung ( P30DK079337) und das Department of Veterans Affairs.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
FITC-inulin | Sigma-Aldrich | F3272 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7706 | |
Isoflurane | Webster Veterinary | 78366551 | |
Dialysis membrane (MWCO 1000) | Spectrum Laboratories | 132636 | |
Membrane closure | Spectrum Laboratories | 132736 | |
80 μl Hematocrit capillaries | Drummond Scientific | 22362566 | |
Hematocrit centrifuge | IEC | Micro-MB | |
10 μl Na+-Heparin minicaps | Hirschmann | 9000210 | |
Syringe (100 μl) | Hamilton | 80601 | |
Fluorospectrometer | Thermo-Fisher Scientific | NanoDrop 3300 | |
Filter (0.22 μm) | Spectrum Laboratories | 880-26464-UE | |
Sealant | Châ-seal | 510 | |
Needles (G26 ½ and G30 ½) | Becton Dickinson | 305111 & 305106 |