Nous décrivons comment utiliser la microdissection par capture laser (LCM) pour obtenir des populations enrichies de neurones de l'hippocampe ou des neurones simples de coupes congelées de cerveau de rat blessé pour l'analyse d'expression génique ultérieure à l'aide quantitative PCR en temps réel et / ou puces à ADN du génome entier.
À long terme des troubles cognitifs après TBI est associé à des lésions neurodégénérescence induite dans l'hippocampe, une région du lobe temporal qui est essentiel pour l'apprentissage, la mémoire et les fonctions exécutives. 1,2 D'où nos études se concentrent sur l'analyse de l'expression des gènes des neurones spécifiques populations dans les sous-régions distinctes de l'hippocampe. La technique de microdissection par capture laser (LCM), introduit en 1996 par Emmert-Buck et al., 3 a permis des avancées significatives dans l'analyse de l'expression des gènes des cellules individuelles et enrichi des populations de cellules provenant de tissus hétérogènes tels que le cerveau des mammifères qui contient des milliers de types de cellules fonctionnelles. 4 Nous utilisons LCM et un modèle de rat bien établie d'une lésion cérébrale traumatique (TBI) pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathogénie de TBI. Suite à percussion de fluide TBI, les cerveaux sont prélevés à des heures prédéterminées après la lésion, immédiatement congelés sur glace sèche,et préparé pour la coupe dans un cryostat. Les cerveaux de rats peut être intégré dans un PTOM et sectionné immédiatement ou stocké pendant plusieurs mois à -80 ° C avant la coupe pour la microdissection par capture laser. En outre, nous utilisons LCM pour étudier les effets de la TCC sur les rythmes circadiens. Pour cela, nous capturons neurones du noyau suprachiasmatique qui contiennent l'horloge maître du cerveau des mammifères. Ici, nous démontrons l'utilisation de LCM pour obtenir simples neurones identifiés (blessés et dégénérer, Fluoro-Jade-positive, ou indemne, Fluoro-Jade-négatif) et des populations enrichies de neurones de l'hippocampe pour l'analyse de l'expression des gènes ultérieure par PCR en temps réel et / ou puces à ADN du génome entier. Ces études LCM-compatibles ont révélé que la vulnérabilité sélective des régions anatomiquement distincts de l'hippocampe du rat sont reflétées dans les différents profils d'expression des gènes de différentes populations de neurones obtenus par LCM à partir de ces régions distinctes. Les résultats de nos études unicellulaires, le casl'on compare les profils transcriptionnels de mourir et à proximité survivant neurones de l'hippocampe, suggèrent l'existence d'un rhéostat la survie des cellules qui régule la mort cellulaire et la survie après un traumatisme cérébral.
Analyse de l'expression génique des tissus hétérogènes a toujours été problématique,. Ceci est particulièrement vrai dans le cerveau des mammifères, qui a environ 5.000 différents types de cellules 4 Avant le développement de la microdissection par capture laser (LCM) technique, les études génomiques sur les effets des TBI in vivo ont été basées sur l'analyse de l'expression des gènes dans une population mixte de cellules cérébrales comprenait non seulement des différents types de cellules neuronales, mais aussi de soutenir les cellules gliales et immunomodulatrices. Les complexes résultant profils d'expression génique obtenus à partir de ces tissus hétérogènes et souvent contradictoires les motifs de blessures provoquées par des signaux cellulaires, peut-être une explication de l'échec des essais cliniques humains de stratégies thérapeutiques avérées efficaces dans des études précliniques de TBI 5.
Pour obtenir une compréhension claire de l'expression génique induite par des blessures chez les populations vulnérables des neurones de la hanche chez le ratcampe, nous avons adopté la technique de la LCM, la première fois par Emmert-Buck et al. 3 Par la suite, nous avons modifié et optimisé cette technique de microdissection par capture efficace des populations enrichies de neurones et les neurones simples pour le profilage de l'ARNm en utilisant quantitative PCR en temps réel et l'analyse des microréseaux . Pour maintenir l'intégrité de l'ARNm dans des coupes congelées de tissus cérébraux pour l'analyse génomique, nous avons modifié les protocoles existants pour la fixation, la coloration et la capture rapide des neurones à partir de surgelés sections de cerveau de rat. Pour l'identification et l'isolement des blessés et des mourants neurones de l'hippocampe, nous avons également optimisé la technique de coloration Fluoro-Jade pour LCM. Fluoro-Jade ne distingue pas entre la mort cellulaire par apoptose et nécrose. Ainsi, tous les types de neurones qui dégénèrent peuvent être détectés par cette tache. 6,7
Ici, nous décrivons le protocole utilisé dans notre laboratoire pour obtenir des pools de neurones qui meurent ou survivent simples ainsi que des andains de enrichie populations de types distincts de cellules neuronales (c.-à-CA1-CA3 neurones pour l'analyse de l'expression des gènes après TBI). La procédure en cas de blessure du cerveau percussion fluide réalisée dans notre laboratoire est décrite en détail dans Shimamura et al., 8 et est très similaire au protocole blessures par percussion de fluide latérale pour souris publiées dans JoVE par Alder et al. 9 Depuis la technique LCM a été démontré qu'ils ont un effet minime ou nul sur l'intégrité de l'ADN, de l'ARN et des protéines dans les tissus, il s'agit d'un excellent outil pour l'analyse moléculaire et de protéines de types de cellules définies.
Cette technique LCM nous a permis de réaliser des progrès importants dans la compréhension des mécanismes moléculaires de la TCC. 8,10,11,12,13 Nous étions les premiers chercheurs d'utiliser cette technique pour démontrer que les sous-régions distinctes de l'hippocampe du rat ont des profils d'expression des gènes qui en corrélation avec leur vulnérabilité sélective des blessures. Nos études ont montré que l'on pouvait quantifier l'expression des gènes, par qPCR, d'aussi peu que 10 cellules laser capturés et que nous pourrions effectuer une analyse de puces à ADN du génome entier d'aussi peu que 600 cellules capturées. LCM serait un outil précieux dans des études similaires de d'autres régions cérébrales qui sont connus pour être impliqués dans divers troubles neurologiques et neuropsychiatriques. Par exemple, des études utilisant LCM ont mis en lumière dans la pathogenèse de la maladie de Parkinson dans les neurones dopaminergiques de la substance noire, 14 et aidé études de profilage du génome entier du noyau accumbens, qui est impliqué dans les circuits de récompense impliqués dans stroubles d'abus ubstance. 15
Hétérogénéité des neurones se traduit au niveau du génome 16 et peut contribuer au manque de succès des traitements expérimentaux pour TBI dans les essais cliniques. Ainsi, notre but est d'utiliser cette technique pour étudier les éléments critiques qui influencent la survie des neurones après un traumatisme cérébral. Notre récente étude profilage du génome entier de la mort et à proximité survivant neurones de l'hippocampe après TBI suggéré qu'un rhéostat cellulaire qui reflète le rapport entre les niveaux d'expression de la survie des cellules aux gènes de mort cellulaire régule le destin des cellules après un traumatisme cérébral. Ces études en cours contribuera à la conception et au développement de stratégies pharmacothérapeutiques qui peuvent influencer positivement le rhéostat la survie cellulaire. En outre, nous utilisons actuellement LCM pour suivre et surveiller les effets potentiels des traitements médicamenteux thérapeutiques dans des neurones d'hippocampe après un traumatisme cérébral. Ainsi, nos études démontrent que les données soigneusement les techniques de manipulation sans RNase et certainsmodifications des protocoles existants, il est possible d'obtenir de haute qualité des échantillons d'ARN à partir de LCM pour l'analyse précise de l'expression génique quantitative.
Cependant, il existe quelques pièges liés aux techniques de LCM. Par exemple, collecter seulement les cellules neuronales sans aucune contamination microglie peut être presque impossible. Dans la couche des cellules pyramidales de l'hippocampe, il a été estimé que 95% des cellules sont des neurones avec 90% de cette population d'être des cellules pyramidales et des interneurones 10%, laissant un petit pourcentage de types de cellules gliales et les autres. 8,17, 18 Dans nos études, nous utilisons Fluoro-Jade un colorant fluorescent qui marque spécifiquement seuls neurones lésés dans le tissu cérébral. Une tache différente qui est un marqueur pour la GFAP serait nécessaire pour colorer les cellules microgliales 19. Collecte uniquement les fluoro-jade teinté simples corps neuronaux assure une population plus homogène de neurones. Un autre problème commun qui peut exiger de dépannage est que le cercle n'est past définie lorsque le laser est déclenché. Si cela se produit, il est nécessaire de vérifier les paramètres du laser et ajuster la puissance et la durée si nécessaire. En outre, il est important de s'assurer que le bouchon est posé à plat sur le tissu et bien placé sur le bras. Se référant au manuel LCM technique ou appeler l'assistance technique sera parfois nécessaire. Après LCM et l'isolement d'ARN, la qualité de l'ARN doit toujours être évaluée à l'aide d'un bioanalyseur avant toute analyse de l'expression génique.
Il existe plusieurs types d'instruments de capture laser actuellement disponibles sur le marché, y compris la découpe laser (Life Technologies, Leica Microsystems) et laser catapultant (Zeiss) les instruments. Notre système LCM fonctionne bien pour la capture de petits nombres de cellules. D'autres systèmes à haut débit et plus automatisée peut être plus appropriée pour l'obtention d'un plus grand nombre de cellules pour l'analyse génomique et protéomique en particulier. En effet, LCM utilisation de ces systèmes automatisés a un grand potentiel pour l'analyse des protein expression dans des cellules ou des populations identifiées enrichies de cellules. 20 En outre, LCM peuvent faciliter l'analyse d'expression génique de cellules immunomarquées, 21 ce qui nous permet d'étudier l'expression des gènes dans des types cellulaires définies indépendamment de la complexité dans les tissus les plus hétérogènes. Ainsi, LCM est un excellent outil pour les études de pointe moléculaires des populations isolées ou enrichie de cellules.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail est financé par R01 NS052532 (à HLH), la Fondation Moody, et le Département d'anesthésiologie. Nous tenons à remercier Laurie Bolding, Christine Courteau Butler et Christy Perry pour leur aide à la rédaction, et Christy Perry pour la présentation et excellente production de toutes les figures, tableaux et objets d'art.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
PixCell IIe Laser Capture Microscope | Life Technologies (Arcturus) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems | LCM0211/LCM0214 | |
Fluoro-Jade | Histo-chem Inc. | #1FJ | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB pharmacy | ||
RNase free barrier pipette tips | Fisher Scientific | 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A | |
Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies) Zeiss Laser Microdissection The PALM family Leica Microsystems |