Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon
Summary
Biz kantitatif gerçek zamanlı PCR ve / veya tüm genom mikroarrayler kullanan sonraki gen ekspresyon analizi için yaralı sıçan beyinlerinin frozen adlı hipokampal nöronlar veya tek nöronların zenginleştirilmiş popülasyonları elde etmek için lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) nasıl kullanılacağı açıklanmıştır.
Abstract
TBH sonrası uzun süreli zihinsel özürlü öğrenme, bellek ve yürütücü işlev için kritik olan medial temporal lobda hipokampus-bir bölgede yaralanma indüklenen nörodejenerasyon ile ilişkilidir. 1,2 Bu nedenle çalışmalarımızı spesifik nöronal gen ekspresyon analizi odaklanmak hipokampus farklı alt bölgelerinde nüfus. Emmert-Buck tarafından 1996 yılında gerçekleştirilen lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) tekniği, et al., 3 tek hücrelerde gen ekspresyonunu analiz açısından önemli gelişmeler için izin verilen ve zenginleştirilmiş olan bu tür içeren bir memeli beyin gibi heterojen bir doku hücre popülasyonları fonksiyonel hücre tipleri binlerce. 4. Biz LCM ve TBH patogenezinde altında yatan moleküler mekanizmalarının araştırılması travmatik beyin hasarı iyi kurulmuş bir sıçan modeli (TBI) kullanın. Sıvı-perküsyon TBI'dan sonra, beyin, hemen kuru buz üstünde dondurulmuş, önceden belirlenmiş bir zaman travma sonrası da kaldırılırve kriyostat kesit için hazırlanmıştır. Sıçan beyinlerinde hemen OCT ve kesitli gömülü veya -80 birkaç ay saklanabilir ° C Lazer yakalama mikrodiseksiyon için kesit önce. Ayrıca, sirkadiyen ritimleri TBI etkilerini incelemek için LCM kullanın. Bunun için, biz memeli beynin ana saat içeren suprakiazmatik nukleus nöronları yakalamak. Burada, gerçek zamanlı PCR ve / tek tespit nöronlar (yaralı ve yozlaşan, Flor-Jade pozitif veya yaralanmamış, Flor-Jade-negatif) ve sonraki gen ekspresyon analizi için hipokampal nöronlar zenginleştirilmiş popülasyonları elde etmek LCM kullanımını göstermek veya tüm-genom mikroarrayler. Bu LCM-etkin çalışmalar sıçan hipokampus anatomik farklı bölgelerin seçici açığı bu farklı bölgelerden LCM elde nöronların farklı toplumlardaki farklı gen ekspresyon profilleri yansıtılır olduğunu ortaya koymuştur. Bizim tek hücre çalışmaları, nereden sonuçlarıBiz, boyama ve bitişik hipokampal nöronların hayatta transkripsiyonel profillerinin karşılaştırılması TBH sonrası hücre ölümü ve hayatta kalma düzenleyen bir hücre sağkalım reosta varlığını düşündürmektedir.
Introduction
Heterojen dokuların gen ekspresyonu analiz her zaman sorunlu olmuştur;. Bu yaklaşık 5.000 farklı hücre tipleri vardır memeli beyninde, özellikle doğrudur önce lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) tekniği, TBI etkileri genomik çalışmaların gelişmesine 4 in vivo olarak farklı nöronal hücre tipleri, aynı zamanda glial ve immünomodülatör hücreleri destekleyen sadece oluşan beyin hücrelerinin karışık bir nüfus gen ekspresyon analizi, esas alınmıştır. Sonuçlanan karmaşık gen ekspresyon profilleri, bu heterojen dokularından elde edilen ve yaralanma indüklenen hücresel sinyalleri, genellikle çelişkili desen TBI. 5 pre-klinik çalışmalarda etkili kanıtlanmış terapötik stratejilerin insan klinik çalışmalarda başarısızlık için bir açıklama olabilir
Sıçan kalça nöronların savunmasız nüfusları yaralanma indüklenen gen ifadesinin net bir anlayış elde etmek içinpocampus, biz ilk Emmert-Buck ve ark LCM tekniği. 3 Daha sonra, biz de kantitatif gerçek zamanlı PCR ve mikroarray analizi kullanılarak nöronlar ve mRNA profilleme için tek nöronların zenginleştirilmiş popülasyonlarının etkin yakalamak için bu mikrodiseksiyon tekniği modifiye ve optimize kabul . Genomik analiz için beyin dokusu frozenda mRNA bütünlüğünü korumak için, sabitleme, boyama ve donmuş sıçan beyin kesitleri nöronları hızlı yakalanması için mevcut protokoller güncellenmiştir. Tanımlama ve yaralı ve ölen hipokampal nöronların izolasyonu için, biz de LCM için Flor-Jade boyama tekniği optimize. Flor-Jade apoptotik ve nekrotik hücre ölümü arasında ayırım yapmaz. Böylece, dejenere olan nöronların bu tür tüm leke. 6,7 ile tespit edilebilir
Burada, tek ölen veya hayatta kalan nöronların havuzların yanı sıra zenginleştirilmiş populati bozkırlarında elde etmek için laboratuarda kullanılan protokol açıklarfarklı nöronal hücre tipleri (TBI sonrası gen ekspresyon analizi için yani CA1-CA3 nöronlar) arasında ons. Laboratuarda yapılan sıvı perküsyon beyin yaralanması için prosedür Shimamura ve ark. 8'de ayrıntılı olarak tarif edilen ve Alder ve arkadaşları tarafından yayımlanan Jüpiter fareler için lateral sıvı-perküsyon hasar protokol ile çok benzer. 9 LCM teknik sahip olduğu DNA bütünlüğü üzerinde çok az veya hiç etkisi olduğu gösterilmiştir, RNA ve dokularda protein, tanımlanmış olan bu hücre tiplerinin moleküler ve protein analizi için mükemmel bir araçtır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu LCM tekniği TBI moleküler mekanizmalarının anlaşılmasında önemli ilerlemeler yapmak için bize sağlamıştır. 8,10,11,12,13 Biz sıçan hipokampus farklı alt bölgeler gen ekspresyon profilleri var olduğunu göstermek için bu tekniği kullanan ilk araştırmacılar olduğunu yaralanma onların seçici açığı ile ilişkilidir. Çalışmalarımız biz 10 gibi az sayıda lazer yakalanan hücreleri, qPCR göre, gen ekspresyonu ölçmek ve biz 600 yakalanan hücreleri gibi birkaç itibaren genom mikroarray analizi gerçekleştirmek verebilecek olabileceğini gösterdi. LCM çeşitli nörolojik ve nöropsikiyatrik hastalıklardaki rolü olduğu bilinen diğer beyin bölgelerinin benzer çalışmalarda değerli bir araç olacaktır. Örneğin, LCM kullanıldığı çalışmalarda ler karışmış ödül devrelerini katılır akumbens genom-geniş profilleme çalışmaları, substantia nigra, 14 dopamin nöronlar Parkinson hastalığının patogenezinde içine ışık tutacak ve yardım etmişubstance kötüye kullanım bozuklukları. 15.
Nöronal heterojenite genom düzeyinde 16 yansiyan ve klinik çalışmalarda TBI için deneysel tedavilerin başarı eksikliğinin katkıda bulunabilir. Böylece, amacımız TBH sonrası nöronal sağkalımı etkileyen kritik unsurları araştırmak için bu tekniği kullanmaktır. Ölüyor ve bitişik TBH sonrası hipokampal nöronların hayatta Bizim son genom profilleme çalışmada hücre ölümüne genler hücre canlılığı ekspresyon düzeylerinin oranı yansıtmaktadır hücresel reosta TBH sonrası hücre kaderinin düzenler önerdi. Bu devam eden çalışmalar olumlu hücre sağkalım reosta etkileyebilir farmakoterapötik stratejilerinin tasarım ve gelişimine katkı sağlayacak. Ayrıca, şu anda TBH sonrası hipokampal nöronlarda potansiyel terapötik ilaç tedavilerinin etkilerini izlemek ve izlemek için LCM kullanın. Böylece, çalışmalar verilen dikkatli RNaz ücretsiz taşıma teknikleri ve bazı göstermekmevcut protokollerde değişiklik, bu doğru kantitatif gen ifadesi için analiz LCM yüksek kaliteli RNA örnekleri elde etmek mümkün olur.
Bununla birlikte LCM teknikleri ile ilgili bir kaç zorluk vardır. Örneğin, herhangi bir mikroglia kontaminasyon olmaksızın sadece sinir hücreleri toplamak neredeyse imkansız olabilir. Hipokampus piramidal hücre tabakası yılında, hücrelerin% 95 glial ve diğer hücre tiplerinin küçük bir yüzdesi bırakarak, piramidal hücreler ve% 10 internöron olmak için bu nüfusun% 90 ile nöronlar. 8,17 olduğu tahmin edilmiştir Çalışmamızda 18 biz Fluoro yeşim özellikle beyin dokusunda yalnızca yaralandı nöronlar etiketler floresan boya kullanın. GFAP için bir belirteç olduğunu farklı bir leke mikroglia leke için gerekli olacaktır. Yalnızca Fluoro yeşim lekeli tek nöron gövdeleri Toplama 19 nöronların daha homojen bir nüfusa sağlar. Sorun giderme gerektirebilir Başka bir yaygın sorun bir daire hiçbir olmasıdırlazer ateşlendiğinde t tanımlanır. Bu durum ortaya çıkarsa, bu lazer ayarlarını kontrol edin ve gerekirse güç ve süresini ayarlamak için gereklidir. Ayrıca kapak dokusu düz yerleştirilir ve kol düzgün oturduğundan emin olmak için önemlidir. LCM teknik el kitabına atıfta bulunarak veya teknik desteği aramadan bazen gerekli olacaktır. LCM ve RNA izolasyonu sonra, RNA kalitesi her zaman önce herhangi bir gen ekspresyon analizi için bir Bioanalyzer ile değerlendirilmelidir.
Lazer kesim (Life Technologies, Leica Microsystems) ve (Zeiss) araçların catapulting lazer dahil olmak üzere şu anda piyasada lazer yakalama araçları çeşitli türleri vardır. Bizim LCM sistemi hücrelerinin az sayıda yakalamak için iyi çalışır. Diğer yüksek verimlilik ve daha fazla otomasyon sistemleri genomik ve özellikle proteomik analizi için hücrelerin büyük sayılar elde etmek için daha uygun olabilir. Nitekim, bu otomatik sistemler kullanılarak LCM pr analizi için büyük bir potansiyele sahiptespit hücrelerin veya hücre popülasyonlarında zenginleştirilmiş otein ifadesi. 20. Ayrıca, LCM bize, en heterojen dokularda karmaşıklık bağımsız olarak tanımlanmış hücre tiplerinde in gen ekspresyonunu araştırmak için izin immunolabeled hücreleri, 21, gen ekspresyonunu analiz kolaylaştırabilir. Böylece, LCM hücrelerin tek veya zenginleştirilmiş popülasyonlarının üstün moleküler çalışmalar için mükemmel bir araçtır.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser R01 NS052532 (HLH için), Moody Vakfı ve Anesteziyoloji Bölümü tarafından finanse edilmektedir. Biz Laurie Kalınlaştırma, kendi editoryal yardım için Christine Courteau Butler ve Christy Perry ve düzeni ve tüm şekil, tablo ve sanat mükemmel üretim için Christy Perry ederim.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
| PixCell IIe Laser Capture Microscope | Life Technologies (Arcturus) | ||
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
| Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Capsure LCM caps | Applied Biosystems | LCM0211/LCM0214 | |
| Fluoro-Jade | Histo-chem Inc. | #1FJ | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma-aldrich | C5042-10G | |
| Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB pharmacy | ||
| RNase free barrier pipette tips | Fisher Scientific | 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A | |
| Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies) Zeiss Laser Microdissection The PALM family Leica Microsystems |
References
- Squire, L. R., Stark, C. E., Clark, R. E. The medial temporal lobe. Annual Review of Neuroscience. 27, 279-306 (2004).
- Bast, T. Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior. Rev. Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).
- Emmert-Buck, M. R., Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. From gene networks to brain networks. Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).
- Schouten, J. W. Neuroprotection in traumatic brain injury: a complex struggle against the biology of nature. Curr. Opin. Crit. Care. 13 (2), 134-142 (2007).
- Schmued, L. C., Albertson, C., Slikker, W. Fluoro-Jade: a novel fluorochrome for the sensitive and reliable histochemical localization of neuronal degeneration. Brain Research. 751 (1), 37-46 (1997).
- Ye, X., Carp, R. I., Schmued, L. C., Scallet, A. C. Fluoro-Jade and silver methods: application to the neuropathology of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy. Brain Res. Brain Res. Protoc. 8 (2), 104-112 (2001).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Mol. Brain Res. 17 (1), 47-61 (2004).
- Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3063 (2011).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., et al. Analysis of long-term gene expression in neurons of the hippocampal subfields following traumatic brain injury in rats. Neurosciences. 131 (1), 87-97 (2005).
- Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice. Exp. Gerontol. 41 (11), 1201-125 (2006).
- Hellmich, H. L., Garcia, J. M., et al. Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons. Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).
- Rojo, D. R., Prough, D. S., et al. Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury. PLoS One. 6 (8), e2311 (2011).
- Elstner, M., Morris, C. M., et al. Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death. Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).
- Chen, H., Liu, Z., et al. Genome-Wide Gene Expression Profiling of Nucleus Accumbens Neurons Projecting to Ventral Pallidum Using both Microarray and Transcriptome Sequencing. Front. Neurosci. 5, 98 (2011).
- Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Amaral, D. G., Ishizuka, N., Claiborne, B. Neurons, numbers and the hippocampal network. Prog. Brain Res. 83, 1-11 (1990).
- Zeng, Y. C., Bongrani, S., et al. Effect of long-term treatment with L-deprenyl on the age-dependent microanatomical changes in the rat hippocampus. Mech. Ageing Dev. 79 (2-3), 169-185 (1995).
- Schmued, L. C., Hopkins, K. J. Fluoro-Jade: novel fluorochromes for detecting toxicant-induced neuronal degeneration. Toxicol. Pathol. 28 (1), 91-99 (2000).
- Banks, R. E., Dunn, M. J., et al. The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis– preliminary findings. Electrophoresis. 20 (4-5), 689-700 (1999).
- Fend, F., Emmert-Buck, M. R., et al. Immuno-LCM: laser capture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis. Am. J. Pathol. 154 (1), 61-66 (1999).
