Microdissection לכידת ליזר אוכלוסיות מועשרות של הנוירונים או נוירונים יחידים לניתוח ביטוי גנים לאחר פגיעה מוחית טראומטית
Summary
אנו מתארים כיצד להשתמש microdissection לכידת הליזר (LCM) להשיג אוכלוסיות מועשרות של נוירונים ביפוקמפוס או נוירונים בודדים מחלקים קפוא של מוח החולדה הפצועה לניתוח ביטוי גנים בעקבות שימוש בזמן PCR הריאלי כמוני ו / או microarrays כל הגנום.
Abstract
לקות קוגניטיבית לטווח ארוך לאחר TBI משויכת לניוון מוחיה הנגרם פגיעה ביפוקמפוס, האזור באונה הטמפורלית מדיאלית שהיא קריטי ללמידה, זיכרון ותפקוד ביצועי. 1,2 לכן המחקרים שלנו להתמקד בניתוח של ביטוי גנים עצביים ספציפי אוכלוסיות באזורי משנה שונים של ההיפוקמפוס. הטכניקה של לכידת microdissection הליזר (LCM), הציגה בשנת 1996 על ידי Emmert-באק, et al., 3 אפשרה להתקדמות משמעותית בניתוח ביטוי גנים של תאים בודדים והעשירה את האוכלוסיות של תאים מרקמות הטרוגניות כמו המוח של יונקים המכיל אלף סוגי תאים פונקציונליים. 4 אנו משתמשים LCM ומודל מבוסס היטב חולדה של פגיעה מוחית טראומטית (TBI) לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס פתוגנזה של TBI. בעקבות נוזל כלי קשה TBI, מוח מוסרים בזמנים שנקבעו מראש, שלאחר פציעה, הוקפא מייד בקרח יבש,ומוכן לחתך בcryostat. את מוח החולדה יכול להיות מוטבע באוקטובר ונותח באופן מיידי, או לאחסן כמה חודשים ב-80 ° C לפני החתך ללכידת microdissection ליזר. בנוסף, אנו משתמשים LCM כדי לחקור את ההשפעות של TBI במקצבי יממה. לשם כך, אנו ללכוד נוירונים מגרעיני suprachiasmatic המכילים את השעון הראשי של המוח של היונקים. הנה, אנחנו מדגימים את שימוש LCM להשיג נוירונים בודדים מזוהים (נפצע ומתנוונת,-Jade חיובי Fluoro, או ללא פגע,-Jade שלילי Fluoro) ואוכלוסיות מועשרות של נוירונים ביפוקמפוס לניתוח ביטוי גנים לאחר מכן על ידי הזמן האמיתי PCR ו / או microarrays שלם הגנום. מחקרי LCM המותאמים אלה חשפו כי הפגיעות סלקטיבית של אזורים אנטומית שונים של היפוקמפוס העכברוש משתקפות בפרופילי ביטוי הגנים השונים של אוכלוסיות שונות של תאי עצב המתקבלים על ידי LCM מהאזורים שונים אלה. התוצאות ממחקרי התא הבודד שלנו, שםאנו משווים את פרופילי תעתיק מיתה וצמודה לשרוד נוירונים ביפוקמפוס, מרמזים על קיומו של ריאוסטט הישרדות תא המווסת את המוות של תאים והישרדות לאחר TBI.
Introduction
ניתוח ביטוי גנים ברקמות הטרוגניות תמיד היה בעייתי;. זה נכון במיוחד במוח של היונקים, שבה יש כ -5,000 סוגי תאים שונים 4 לפני התפתחות microdissection ליזר הלכידה (LCM) טכניקה, המחקרים גנטיים של ההשפעות של TBI in vivo התבססו על ניתוח של ביטוי גנים באוכלוסייה מעורבת של תאי מוח המורכבים, לא רק של סוגי תאים עצביים שונים, אלא גם בתמיכה במערכת חיסונית ותאי גליה. את פרופילי ביטוי הגנים המורכבים הנובעים מתקבלים מרקמות הטרוגניות אלה, ואת הדפוסים המתנגשים התדירים של אותות סלולריים פציעה מושרה, עשויים להיות הסבר אחד לכישלון בניסויים קליניים בבני אדם של אסטרטגיות טיפוליות הוכח כיעיל במחקרים טרום קליניים של TBI. 5
כדי להשיג הבנה ברורה של ביטוי גני פגיעה הנגרם באוכלוסיות חלשות של נוירונים ממותן העכברושpocampus, אמץ את הטכניקה של LCM, שפורסם לראשונה על ידי Emmert-אק et al. 3 לאחר מכן, אנחנו שונים ומותאמים טכניקת microdissection זה ללכידה יעילה של אוכלוסיות מועשרות של נוירונים ונוירונים בודדים ליצירת פרופילי mRNA באמצעות PCR זמן אמיתי כמוני וניתוח microarray . כדי לשמור על היושרה של mRNA בסעיפים קפוא של רקמת מוח לניתוח גנומי, אנחנו שונים פרוטוקולים קיימים לתיקון, צביעה ולכידה מהירה של תאי עצב מחלקי מוח חולדה קפואות. לזיהוי ולבידוד של תאי עצב ביפוקמפוס פצועים וגוססים, אנחנו גם אופטימיזציה טכניקת צביעת Fluoro-Jade לLCM. Fluoro-Jade אינו מבחין בין מוות של תאים אפופטוטיים ונימקים. לפיכך, בכל סוגי תאי עצב מנוון יכולים להיות מזוהים על ידי כתם. 6,7 זה
כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול המשמש במעבדה שלנו כדי לקבל ברכות של נוירונים גוססים או ששרדו בודדים, כמו גם תלמים המועשר populatiתוספות של סוגי תאים עצביים ברורים (כלומר CA1-CA3 נוירונים לניתוח ביטוי גנים לאחר TBI). ההליך לפגיעה מוחית כלי קשה נוזל שבוצעה במעבדתנו מתואר בפירוט בShimamura et al., 8 והוא דומה מאוד לפרוטוקול פציעת רוחב נוזל כלי הקשה לעכברים שפורסמו ביופיטר ידי Alder et al. 9 מאז טכניקת LCM יש נראה שיש לי מינימאלית או ללא השפעה על היושרה של DNA, RNA וחלבון ברקמות, זה כלי מצוין לניתוח מולקולרי וחלבונים מסוגי תאים מוגדרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקת LCM זו אפשרה לנו לבצע התקדמות משמעותית בהבנת המנגנונים המולקולריים של TBI. 8,10,11,12,13 היינו החוקרים הראשונים לנצל טכניקה זו כדי להוכיח כי אזורי משנה שונים של היפוקמפוס העכברוש יש פרופילי ביטוי גנים ה לתאם עם הפגיעות סלקטיבית שלהם לפציעה. המחקרים שלנו הראו שאנחנו יכולים לכמת ביטוי גנים, בqPCR, מכמה כמו 10 תאי ליזר שנתפסו ושאנחנו יכולים לבצע ניתוח microarray הגנום מכמה כמו 600 תאים שנתפסו. LCM יהיה כלי חשוב במחקרים דומים באזורים אחרים במוח שידוע כי הם יהיו מעורבים בהפרעות נוירולוגיות ונוירופסיכיאטריות מגוונות. לדוגמה, מחקרים באמצעות LCM שפכו אור בפתוגנזה של מחלת פרקינסון בנוירונים של דופאמין substantia nigra, 14 ונעזרו מחקרי הגנום כל אפיון של הגרעין הנסמך, העוסקים במעגלי תגמול מעורבים בזההפרעות ubstance 15 התעללות.
ההטרוגניות עצבית מתבטאת ברמת הגנום 16 ועשויות לתרום לחוסר הצלחה של טיפולים ניסיוניים לTBI בניסויים קליניים. לכן, המטרה שלנו היא לנצל את הטכניקה הזאת כדי לחקור את האלמנטים קריטיים המשפיעים על הישרדות תאי עצב לאחר TBI. המחקר האחרון שלנו הגנום הפרופיל של גסיסה וצמודה לשרוד נוירונים ביפוקמפוס לאחר TBI הציע שריאוסטט סלולרי המשקף את היחס בין רמות הביטוי של גנים להישרדות תא מוות של תאים מווסת גורל תא לאחר TBI. מחקרים מתמשכים אלו יתרמו לעיצוב והפיתוח של אסטרטגיות pharmacotherapeutic שיכול להשפיע באופן חיובי ריאוסטט הישרדות התא. יתר על כן, אנו משתמשים כיום LCM לעקוב ולנטר את ההשפעות של טיפולים תרופתיים טיפוליים פוטנציאליים בנוירונים ביפוקמפוס לאחר TBI. לכן, המחקרים שלנו מראים כי טכניקות שניתנו זהירות RNase ללא טיפול וכמהשינויים של פרוטוקולים קיימים, ניתן להשיג דגימות RNA איכות גבוהות מLCM לניתוח ביטוי מדויק כמו גן.
עם זאת יש כמה חסרונות הקשורים בטכניקות LCM. לדוגמה, איסוף רק תאים עצביים ללא כל זיהום המיקרוגליאה יכול להיות כמעט בלתי אפשרי. בשכבת תאי הפירמידה של ההיפוקמפוס זה כבר העריך כי 95% מתאי נוירונים עם 90% מאוכלוסייה זו כתאי פירמידה וinterneurons 10%, מותיר אחוז קטן של סוגי התאים גלייה ואחרים. 8,17, 18 במחקרים שלנו אנו משתמשים Fluoro-ירקן צבע פלואורסצנטי כי תוויות נוירונים נפגע רק ברקמת המוח באופן ספציפי. כתם שונה שמהווה סמן לGFAP יהיה צורך להכתים המיקרוגליאה. איסוף רק 19 הגופות העצביות הבודדות המוכתמות Fluoro-הירקן מבטיח אוכלוסייה הומוגנית יותר של תאי עצב. בעיה נפוצה נוספת שעשויה לדרוש פתרון בעיות היא שהמעגל הוא לאלא מוגדר כאשר הליזר הוא ירה. במקרה זה, יש צורך לבדוק את גדרות הליזר ולהתאים את העצמה והמשך במידת צורך. כמו כן חשוב לוודא שהכובע מונח שטוח על הרקמות וישובה בצורה נכונה בזרוע. בהתייחסו למדריך הטכני LCM או מתקשר לתמיכה טכנית יהיה לפעמים יהיה צורך. בעקבות LCM ובידוד RNA, את האיכות של RNA צריכה להיות תמיד הוערכה באמצעות bioanalyzer לפני כל ניתוח ביטוי גנים.
ישנם מספר סוגים של מכשירי ליזר ללכוד כיום בשוק, כולל חיתוך בליזר (חי טכנולוגיות, סאן יקה) וליזר catapulting מכשירים (Zeiss). מערכת LCM שלנו עובדת היטב עבור לכידת מספר קטן של תאים. מערכות תפוקה גבוהה יותר ואוטומטיות אחרות עשויות להיות מתאימות יותר להשגת מספר גדול יותר של תאים לניתוח גנומי ובמיוחד proteomic. אכן, LCM באמצעות המערכות האוטומטיות הללו יש פוטנציאל גדול לניתוח של יחסי הציבורביטוי otein בחוליות מזוהות או אוכלוסיות מועשרות של תאים. 20 יתר על כן, LCM יכול להקל על ניתוח ביטוי גנים של תאי immunolabeled, 21 מאפשרים לנו לחקור את ביטוי גנים בתאים מסוגים מוגדרים ללא תלות במורכבות ברקמות הטרוגניות ביותר. לפיכך, LCM הוא כלי מצוין למחקרים מולקולריים חדשניים של אוכלוסיות בודדות או מועשרות של תאים.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו ממומנת על ידי R01 NS052532 (לHLH), מודי הקרן, ומחלקת ההרדמה. אנו מודים לורי ולדינג, כריסטין Courteau אטלר וכריסטי פרי לסיוע העריכה שלהם, וכריסטי פרי לפריסה והפקה מצוינת של כל דמויות, השולחנות ועבודות האמנות.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
| PixCell IIe Laser Capture Microscope | Life Technologies (Arcturus) | ||
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
| Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Capsure LCM caps | Applied Biosystems | LCM0211/LCM0214 | |
| Fluoro-Jade | Histo-chem Inc. | #1FJ | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma-aldrich | C5042-10G | |
| Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB pharmacy | ||
| RNase free barrier pipette tips | Fisher Scientific | 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A | |
| Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies) Zeiss Laser Microdissection The PALM family Leica Microsystems |
References
- Squire, L. R., Stark, C. E., Clark, R. E. The medial temporal lobe. Annual Review of Neuroscience. 27, 279-306 (2004).
- Bast, T. Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior. Rev. Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).
- Emmert-Buck, M. R., Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. From gene networks to brain networks. Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).
- Schouten, J. W. Neuroprotection in traumatic brain injury: a complex struggle against the biology of nature. Curr. Opin. Crit. Care. 13 (2), 134-142 (2007).
- Schmued, L. C., Albertson, C., Slikker, W. Fluoro-Jade: a novel fluorochrome for the sensitive and reliable histochemical localization of neuronal degeneration. Brain Research. 751 (1), 37-46 (1997).
- Ye, X., Carp, R. I., Schmued, L. C., Scallet, A. C. Fluoro-Jade and silver methods: application to the neuropathology of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy. Brain Res. Brain Res. Protoc. 8 (2), 104-112 (2001).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Mol. Brain Res. 17 (1), 47-61 (2004).
- Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3063 (2011).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., et al. Analysis of long-term gene expression in neurons of the hippocampal subfields following traumatic brain injury in rats. Neurosciences. 131 (1), 87-97 (2005).
- Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice. Exp. Gerontol. 41 (11), 1201-125 (2006).
- Hellmich, H. L., Garcia, J. M., et al. Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons. Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).
- Rojo, D. R., Prough, D. S., et al. Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury. PLoS One. 6 (8), e2311 (2011).
- Elstner, M., Morris, C. M., et al. Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death. Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).
- Chen, H., Liu, Z., et al. Genome-Wide Gene Expression Profiling of Nucleus Accumbens Neurons Projecting to Ventral Pallidum Using both Microarray and Transcriptome Sequencing. Front. Neurosci. 5, 98 (2011).
- Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Amaral, D. G., Ishizuka, N., Claiborne, B. Neurons, numbers and the hippocampal network. Prog. Brain Res. 83, 1-11 (1990).
- Zeng, Y. C., Bongrani, S., et al. Effect of long-term treatment with L-deprenyl on the age-dependent microanatomical changes in the rat hippocampus. Mech. Ageing Dev. 79 (2-3), 169-185 (1995).
- Schmued, L. C., Hopkins, K. J. Fluoro-Jade: novel fluorochromes for detecting toxicant-induced neuronal degeneration. Toxicol. Pathol. 28 (1), 91-99 (2000).
- Banks, R. E., Dunn, M. J., et al. The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis– preliminary findings. Electrophoresis. 20 (4-5), 689-700 (1999).
- Fend, F., Emmert-Buck, M. R., et al. Immuno-LCM: laser capture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis. Am. J. Pathol. 154 (1), 61-66 (1999).
