Summary

Mitokondri ilişkili ER Membranlar (MAM) ve Glycosphingolipid zenginleştirilmiştir Microdomains (GEM'lerle): Fare Beyin izolasyon

Published: March 04, 2013
doi:

Summary

Bu işlem yetişkin fare beyin mitokondri ilişkili ER membranlar veya MAM ve MAM ve mitokondriyal hazırlıkları glycosphingolipid zenginleştirilmiş microdomain fraksiyonları izole etmek için nasıl göstermektedir.

Abstract

Hücre içi organel ve hücre şekli özel akışı içsel ve dışsal uyaranlara maruz bileşim, değişen yüksek dinamik yapılardır. Onların membranlar genellikle sinyal molekülleri ve membran bileşenlerinin 1,2,3,4 alışverişi için hub haline tanımlanan temas sitelerde, yan yana. Endoplazmik retikulum (ER) ve + kanal mitokondri ilişkili-ER membran veya MAM 4,5,6 olarak bilinir IP3 duyarlı Ca 2 açılışında mitokondri arasında oluşan inter-organel zarı microdomains. Protein / lipit bileşimi ve bu membran temas sitelerin biyokimyasal özellikleri yaygın, özellikle hücre içi Ca 2 + 4,5,6 düzenlenmesinde kendi rolü ile ilgili olarak çalışılmıştır. ER +, ve bu sıfatla Ca 2 mansap hücresel süreçlerin sayısız düzenleyen hücre içi Ca 2 primer deposu olarak hizmet + sinyalizasyon dahiltranslasyon sonrası protein katlanması ve protein maturation7 uding. Mitokondri, diğer taraftan, bu şekilde alt-Ca 2 + balanssızlık 4,8 apoptotik yollarının önlenmesi başlatma sitosolik Ca2 + konsantrasyon tamponlama göre, Ca2 + homeostazını korumak. MAM ve dinamik yapısı onları ideal sitesi Ca 2 + sinyalizasyon ve mitokondrial Ca 2 + konsantrasyonu, lipit biyosentezi ve taşınması, enerji metabolizması ve hücre sağkalımı 4,9,10,11,12 düzenlenmesi de dahil olmak üzere temel hücresel mekanizmaları incelemek için yapar. Birçok protokol karaciğer doku ve kültürlenmiş hücrelerde 13,14 bu microdomains saflaştırılması için tarif edilmiştir.

Dikkate önceden yayınlanmış yöntemleri alırsak, biz yetişkin fare beyin mitokondri ve MAM ve izolasyonu için bir protokol adapte var. Bu prosedür için biz ekstra bir saflaştırma adımı, yani bir Triton X100 ekstraksiyon, eklemiş hangi enables MAM arasında glycosphingolipid zenginleştirilmiş microdomain (GEM) fraksiyonu izolasyonu. Bu GEM hazırlıklar plazma zarı veya diğer intrasellüler membranların elde caveolae ve lipid sallar, birkaç protein bileşenleri paylaştığı ve reseptör proteinlerinin kümeleme için puan toplamak olarak ve protein-protein etkileşimleri 4,15 için çalışması önerilmiştir.

Protocol

Aşağıdaki protokol fare beyin MAM ve GEM'lerle izolasyonu ve saflaştırılması için tasarlanmıştır Çözümler mitokondri, MAM ve GEM'lerle izolasyonu için gerekli Fraksiyonlama ham mitokondriyal hazırlığının sağlanması: Çözelti A: 0.32 M sukroz, 1 mM NaHCO 3, 1 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2 + proteaz inhibitörleri (gerektiği kadar taze ekleyin) <p class="j…

Representative Results

Biz güvenle MAM, GEM'lerle ve fare beyin mitokondriyal kesirler izolasyonu ve saflaştırılması için tavsiye ederim bu protokolü kullanarak bizim deneyimlerine dayanarak. Özetlenen prosedür yüksek oranda tekrarlanabilir ve tutarlıdır. Şekil 1'de bir Percoll degrade (adım 3.4) üzerine bir şekilde saf mitokondri ve MAM tabakasının temsilcisi görüntüsünü gösterebilir. MAM fraksiyonu mitokondri üzerinde yaygın ve geniş bant yukarı yapar iken içeren tanımlanmış, sütlü …

Discussion

Intrasellüler membranlar arasında veya organel ve hücre plazma zarı arasındaki temas siteleri temel hücresel süreçler için dinamik sinyal platformlarda temsil etmektedir. Fizyolojik ve patolojik koşullarda hem altında işlev ve kompozisyon doğru karakterizasyonu güvenilir ve tekrarlanabilir arıtma protokolü gerektirir. Burada ayrıntılı yöntemler özellikle erişkin fare beyin MAM ve bunlara karşılık gelen GEM'lerle izolasyonu ve saflaştırılması için laboratuvar tarafından optimize edilmi?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz ilk protokol tasavvur eden Renata Sano katkısını kabul. Ad'A. Genetik ve Gen Terapisi Sandalye Bahşedilen Çocuklar (JFC) için Kuyumcular tutar. Bu çalışma NIH hibe GM60905, DK52025 ve CA021764 ve Amerikan Lübnan Suriye İlişkili Charities (Alsaç) tarafından finanse edildi.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
REAGENTS
Fractionation
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S-5761
Magnesium Chloride, Hexahydrate Fisher Scientific BP214-500
Calcium Chloride, Dihydrate Sigma-Aldrich C-5080
MAM
D-Mannitol Sigma-Aldrich M9546-250G
Hepes Fisher Scientific BP310-500
EGTA Sigma-Aldrich E4378-250G
BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate Roche 03-116-964-001
Percoll GE 17-0891-02
GEM
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500 ml
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Tris Base Roche 03-118-142-001
HCl Fisher Scientific A144S-500
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500
Common
Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free Roche 11-873-580-001
EQUIPMENT
2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders Kimble Chase 885300-0002
15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon BD 352097
30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-30
15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-15
Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14×89 mm Beckman-Coulter 344059
Parafilm Cole-Parmer PM996
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9″ Fisher Scientific 13-678-20C

References

  1. Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
  2. Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
  3. Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
  4. Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d’Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
  5. Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
  6. Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
  7. d’Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
  8. Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
  9. Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
  10. Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
  11. Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
  12. Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
  13. Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
  14. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
  15. Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).

Play Video

Citer Cet Article
Annunziata, I., Patterson, A., d’Azzo, A. Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain. J. Vis. Exp. (73), e50215, doi:10.3791/50215 (2013).

View Video