Summary

ממברנות המיטוכונדריה הקשורים ER (MAMs) וMicrodomains Glycosphingolipid המועשר (אובניים חן): בידוד ממוח עכבר

Published: March 04, 2013
doi:

Summary

הליך זה מדגים כיצד לבודד מהמוח המבוגר עכבר קרומי המיטוכונדריה או MAMs הקשורים ER וmicrodomain המועשרים glycosphingolipid השברים מMAMs ותכשירי המיטוכונדריה.

Abstract

האברונים תאיים הם מבנים דינמיים מאוד עם צורות שונות ובהרכב, שכפופים לרמזים פנימיים וחיצוניים של תאים ספציפיים. הקרומים שלהם לעתים קרובות באתרי juxtaposed מגע מוגדר, אשר הופכים לרכזות חילופי מולקולות איתות ורכיבי קרום 1,2,3,4. את microdomains הקרום בין organellar שנוצרו בין reticulum endoplasmic (ER) ואת המיטוכונדריה בפתיחת Ca IP3 הרגיש 2 + ערוץ ידוע כמו קרומים קשורים-ER מיטוכונדריה או MAMs 4,5,6. רכב חלבונים / שומנים והתכונות הביוכימיות של אתרי מגע קרום אלה נחקרו רבים בעיקר בהקשר לתפקידם בוויסות התאי Ca 2 + 4,5,6. ER משמש כחנות העיקרית של Ca 2 + התאי, ובמסגרת זו מווסתת מספר עצום של תהליכים תאיים במורד זרם של Ca 2 + איתות, כוללuding מתקפל וחלבון maturation7 חלבון שלאחר translational. המיטוכונדריה, לעומת זאת, לשמור על Ca 2 + הומאוסטזיס, על ידי אגירת cytosolic Ca 2 + ריכוז ובכך למנוע את החניכה של מסלולים אפופטוטיים במורד הזרם של Ca 2 + איזון 4,8. האופי הדינמי של MAMs הופך אותם אידיאליים אתרים לנתח מנגנונים תאיים בסיסיים, כולל Ca 2 + איתות ובקרה של המיטוכונדריה Ca 2 + ריכוז, ביוסינתזה שומנים ותחבורה, חילוף חומרים של אנרגיה ותא הישרדות 4,9,10,11,12. כמה פרוטוקולים שתארו לטיהור microdomains אלה מרקמת כבד ותאים בתרבית 13,14.

לוקח שיטות שפורסמו בעבר בחשבון, יש לנו מותאם פרוטוקול לבידוד של המיטוכונדריה וMAMs ממוח העכבר הבוגר. להליך זה יש לנו הוספתי שלב נוסף טיהור, כלומר מיצוי x100 טריטון, שדוארnables הבידוד של שבריר glycosphingolipid המועשר microdomain (GEM) של MAMs. הכנות GEM אלה חולקים מספר מרכיבי חלבון עם רפסודות caveolae ושומנים בדם, הנגזרות מקרום הפלזמה או קרומים תאיים אחרים, והציעו לשמש איסוף נקודות עבור האשכולות של חלבוני הקולטן ולאינטראקציות בין חלבונים 4,15.

Protocol

הפרוטוקול הבא מיועד לבידוד והטיהור של MAMs ופנינים ממוח העכבר פתרונות הנדרשים לבידוד, MAMs ופניני מיטוכונדריה חלוקה להשיג הכנת המיטוכונדריה גולמית: פ…

Representative Results

בהתבסס על הניסיון שלנו בשימוש בפרוטוקול זה אנו יכולים בבטחה ממליצים עליו לבידוד והטיהור של MAMs, אובניים חן ופיצולי המיטוכונדריה ממוח עכבר. ההליך כפי שמתואר הוא שחזור ומתואם היטב. באיור 1 אנו מראים תמונה מייצגת של דרך שכבת המיטוכונדריה וMAMs הטהורה בשיפוע Percoll (?…

Discussion

האתרים של מגע בין קרומים תאיים או בין האברונים וקרום הפלזמה של תאים מייצגים פלטפורמות איתות דינמיות לתהליכים תאיים בסיסיים. האפיון המדויק של התפקוד ובהרכב שלהם תחת שני תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים דורש פרוטוקולי טיהור אמינות ושחזור. השיטות, כמפורט כאן כבר מותאמות ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מכירים בתרומה של הרנטה סנו בהריון הפרוטוקול הראשוני. Ad'A. מחזיק את התכשיטים לילדים (JFC) ניחן קתדרה לגנטיקה וריפוי גנטי. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי מענקי NIH GM60905, DK52025 וCA021764, ואת הצדקה האמריקנית הלבנונית הסורית, המזוהית (ALSAC).

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
REAGENTS
Fractionation
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S-5761
Magnesium Chloride, Hexahydrate Fisher Scientific BP214-500
Calcium Chloride, Dihydrate Sigma-Aldrich C-5080
MAM
D-Mannitol Sigma-Aldrich M9546-250G
Hepes Fisher Scientific BP310-500
EGTA Sigma-Aldrich E4378-250G
BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate Roche 03-116-964-001
Percoll GE 17-0891-02
GEM
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500 ml
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Tris Base Roche 03-118-142-001
HCl Fisher Scientific A144S-500
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500
Common
Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free Roche 11-873-580-001
EQUIPMENT
2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders Kimble Chase 885300-0002
15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon BD 352097
30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-30
15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-15
Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14×89 mm Beckman-Coulter 344059
Parafilm Cole-Parmer PM996
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9″ Fisher Scientific 13-678-20C

References

  1. Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
  2. Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
  3. Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
  4. Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d’Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
  5. Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
  6. Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
  7. d’Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
  8. Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
  9. Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
  10. Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
  11. Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
  12. Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
  13. Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
  14. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
  15. Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).

Play Video

Citer Cet Article
Annunziata, I., Patterson, A., d’Azzo, A. Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain. J. Vis. Exp. (73), e50215, doi:10.3791/50215 (2013).

View Video