Summary

의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨<em> Drosophila melanogaster</em

Published: March 04, 2013
doi:

Summary

우리는 중추 신경 시스템에 하나의 뉴런을 라벨에 대한 기술 (CNS)의 제시<em> Drosophila</em> 전송 빛 또는 공 촛점 현미경에 의해 neuronal 형태의 분석을 허용 배아.

Abstract

이 글에서 우리는 개별적으로 lipophilic 형광 막 마커 DiI의 juxtacellular 주입에 의한 Drosophila melanogaster의 배아 CNS의 뉴런에 레이블을하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 아주 자세히 neuronal 세포 형태의 시각화 할 수 있습니다. 그것은 CNS에있는 셀에 레이블을 할 수 있습니다 : 대상 뉴런의 세포 기관은 DIC 광학에서 또는 GFP 등의 형광 유전자 마커의 표현으로 시각화 수 있습니다. 라벨 후, DiI는 전송 빛과 DIC 광학으로 세포 형태의 시각화를 허용하도록 photoconversion하여 영구적 인 갈색 얼룩로 변환 할 수 있습니다. 또는 DiI – 라벨 세포는 유전자 도입 형광 기자 단백질이 colocalised 할 수 있도록, 공 촛점 현미경과 직접 관찰 할 수 있습니다. 기술은이 가능 단세포 해상도 돌연변이 phenotypes을 분석하고, 관계없이 유전자형의 모든 동물에서 사용할 수 있습니다.

Introduction

개별 셀의 수준에서 neuronal 형태의 지식은 neuronal 연결 및 CNS 기능을 이해하는 중요한 전제 조건이다. 따라서, 신경 과학의 초기에서, 연구자는 단일 셀 라벨 기술 (이 문제의 역사적인 치료 7 참조) 개발을 모색하고있다. 이러한 Golgi의 착색 등의 고전 방법은 neuronal 형태의 우수한 해상도를 제공하지만, 하나는 착색이 임의의 방식으로 발생 등의 이동 방법으로 신경 세포의 특정 유형의 라벨을 추구하는 경우 적합하지 않습니다. microelectrode에서 염료의 세포 또는 juxtacellular 주입하여 단일 세포를 얼룩위한 방법의 개발은 특정 상표의 요구 사항을 해결.

Drosophila에 하나의 뉴런 염료 주입의 응용 프로그램 때문에 유기체와 뉴런 모두의 작은 크기, 큰 도전을 제시. 배아 Drosophila의 그럼에도 불구하고, 단일 신경 세포의 착색 </em> 뉴런은 코리 굿맨 (15)의 연구실에서 1980 년대 중반에 달성되었다. 방법은 eminently 유용하고 지난 20~30년 (예 : 2, 10) 이상 Drosophila의 neuronal 개발을위한 메커니즘으로 몇 가지 주요 통찰력을 제공하고 있지만, 많은 근로자는 주로 때문에 기술적 요구의 그것과 떨어져 shied했습니다.

Drosophila의 neuronal 라벨에 유전자 기술의 최근 몇 년 동안 사용 가능 여부는 하나의 신경 세포의 색소 주입의 unpopularity에 공헌하고 있습니다. 막 타겟 GFP 구조의 GAL4-지시 표현은 신경 형태 1, 20 뛰어난 해상도를 제공 할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 특정 제한이 있습니다 : 여러 셀에 GFP의 자주 불가피한 표현은 개별 뉴런의 구조를 가리 수 있으며 GAL4 드라이버 라인은 관심의 특정 신경 세포에 표현을 유도 할 수되지 않을 수 있습니다. MARCM (담당자와 모자이크 분석ressible 세포 마커) 방법 8은 개별 세포 수준에서 본질적으로 어떤 신경 세포의 라벨 있지만, 성공적으로 인해 GAL80 단백질의 느린 매출의 배아와 초기 유충에 사용할 수 없습니다를 제공 할 수 있습니다.

유전자 라벨 이러한 제한을 감안할 때, 우리는 Drosophila의 배아에서 해당 단일 신경 세포의 색소 주입이 귀중한 기술을 유지하고 폭 넓은 응용을받을 권리가 생각합니다. 이러한 목표를 촉진하기 위해, 우리는 여기 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 힘의 그림은 후반 Drosophila의 배아 (14)의 복부 neuromeres의 interneurons의 전체 세트의 형태와 우리의 최근 계정에 의해 제공됩니다. 개인 neuronal 세포 유형의 형태학의 다양성과 배의 CNS에서 neuromere 조직의 원리를 모두 공개이 연구는 다른 현재 분류​​ 방법으로 불가능했을 것입니다.

Protocol

우리는 우리의 실험실에서 단일 신경 세포의 라벨 방식의 두 약간 다른 변종을 사용했습니다. 차이는 배아의 수집, dechorionisation, devitellinisation 및 배아 시체를 저민 단계에 관한 것이다. 그림 1은 변종의 공동와 발산 단계에 대한 개요를 제공합니다. 1. 염료 주입을위한 배아 해부 및 Micropipettes를위한 마이크로 바늘의 작성 배아 해부 용 유리 바늘은 셔터 ?…

Representative Results

그림 4는 기술의 전형적인 결과를 보여줍니다, 우리는 여기에 대해 설명합니다. 그림 4A 확실히 해두 고 photoconverted 된 DiI 가득 단일 interneuron의 예를 보여줍니다. 그것은 멋지게 세부의 양이 준비 제공을 보여줍니다. 비 라벨 주변 조직 내에있는 레이블 셀의 공간적 맥락이 표시되고 DIC 광학에서 볼 때, 피질 내의 neuropile 내의 섬유 투영의 전지 본체의 위치를 지정할 수?…

Discussion

모델 시스템으로 Drosophila 중 하나 큰 장점은 단일 세포 수준의 개발과 기능의 분석을 허용한다는 것입니다. 이 세포 유형의 다양성이 매우 높은이며, 이웃 세포의 기능과 형태가 완전히 다를 수 신경계에 관한 특히 유용합니다.

우리가 여기서 제시하는 방법 중 하나 영구적 인 얼룩이나 형광 현미경에 의해 직접 검사로 변환 할 수있는 염료 개별 뉴런의 라벨 수 있습니…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 DFG에서 그리니치 표준시로 보조금에 의해 지원되었다

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
      REAGENTS
DAB Sigma-Aldrich D-5905 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4
DiI Invitrogen/Molecular Probes D-282 1 mg/ml in ethanol
Formaldehyde Merck Millipore   7,4 % in PBS
Glycerol Roth 3783 70% in PBS
Heptane Glue Beiersdorf AG Cello 31-39-30 * dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane
PBS     1x
TRIS Roth 4855  
Vectashield Vector Laboratories H1000  
      EQUIPMENT
Confocal Microscope Leica TCS SP2 to view and document labelings in fluorescence
DC – amplifier Dragan Corporation Cornerstone ION-100 to perform the labelings
Coverslips Menzel BB018018A1 18 x 18 mm
Coverslips Menzel BB024060A1 24 x 60 mm
Dissecting Microscope Leica MZ8 to prepare and disect embryos
Flat Capillaries Hilgenberg   outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm
Injection Capillaries Science Products GB 100 TF 8P  
Micromanipulator R Leica   to perform the labelings
Model P-97 Sutter Instruments   to pull capillaries
Object Slides Marienfeld Superior 1000000  
Scientific Microscope Zeiss Axioskop 2 mot to view labelings after photoconversion
Scientific Microscope Olympus BX50 to perform the labelings
Sony MC3255 Video Camera Sony/AVT Horn Sony MC3255 to record labelings after photoconversion

Table 1.

References

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Citer Cet Article
Rickert, C., Kunz, T., Harris, K., Whitington, P., Technau, G. Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (73), e50150, doi:10.3791/50150 (2013).

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