אנו מציגים טכניקה לסימון תאי עצב בודדים במערכת העצבים המרכזית (CNS) של<em> דרוזופילה</em> עוברים, המאפשר הניתוח של מורפולוגיה עצבית על ידי אור או שודר או מיקרוסקופיה confocal.
במאמר זה יתאר כיצד בנפרד לתייג תאי עצב במערכת העצבים המרכזיים העוברית של דרוזופילה melanogaster על ידי ההזרקה של juxtacellular DiI סמן lipophilic ניאון הממברנה. שיטה זו מאפשרת הדמיה של מורפולוגיה של תאים עצבית בפירוט רב. אפשר לתייג את כל תאים במערכת העצבים מרכזיים: גופי תא של הנוירונים היעד הם דמיינו תחת אופטיקה DIC או על ידי ביטוי של סמן גנטי ניאון כגון ה-GFP. לאחר תיוג, DiI יכול להפוך לחום קבוע כתם ידי photoconversion כדי לאפשר הדמיה של מורפולוגיה תא עם אור מועבר ואופטיקה DIC. לחלופין, את התאים שכותרת DiI-ניתן לצפות ישירות עם מיקרוסקופיה confocal, המאפשרים חלבוני כתב ניאון הציגו גנטי להיות colocalised. הטכניקה יכולה לשמש בכל בעל חיים, ללא קשר לגנוטיפ, כך שניתן לנתח פנוטיפים מוטציה ברזולוצית תא בודדה.
ידע של מורפולוגיה עצבית ברמה של תאים בודדים הוא תנאי מפתח להבנת קישוריות עצבית ותפקוד מערכת עצבים מרכזיים. כך, החל מהימים הראשונים של מדעי המוח, החוקרים בקשו לפתח טכניקות תיוג תא בודדות (ראה 7 לטיפול הסטורי של בעיה זו). שיטות קלסיות כגון צביעת Golgi לספק רזולוציה מצוינת של מורפולוגיה עצבית אך אינן מתאימים אם אחד מבקש לתייג סוג מסוים של נוירון באופן מכוון, כמכתים מתרחשת באופן אקראי. הפיתוח של שיטות להכתמת תאים בודדים על ידי הזרקה תאית או juxtacellular של צבעים מmicroelectrode התייחס לדרישה של תיוג ספציפי.
היישום של זריקה אחת נוירון לצבוע כדי תסיסנית הציג אתגר גדול, בגלל גודלו הקטן של שניהם האורגניזם ותאי העצב שלה. עם זאת, כתמי נוירון בודדים של עוברית דרוזופילה </emהנוירונים> הושגו באמצע 1980 במעבדה של הקורים 15 גודמן. בעוד השיטה הייתה בהחלט שימושית וספקה כמה תובנה חשובות על מנגנונים להתפתחות עצבית בדרוזופילה במשך 20-30 השנים האחרונות (לדוגמה, 2, 10), עובדים רבים נרתעו ממנו, בעיקר בגלל הדרישות הטכניות שלה.
הזמינה בשנים האחרונות יותר של טכניקות גנטיות לתיוג עצבי בדרוזופילה גם תרם לפופולריות של הזרקת צבע נוירון בודדה. ביטוי GAL4 ביים של מבני GFP קרום ממוקדים יכול לספק פתרון מצוין למורפולוגיה עצבית 1, 20. עם זאת, לשיטה זו יש מגבלות מסוימות: הביטוי לעתים קרובות בלתי הנמנע של ה-GFP בתאים מרובים יכול לטשטש את המבנה של תאי עצב בודד וקו נהג GAL4 לא יהיה זמין לנהוג ביטוי בתא עצב מסוים של ריבית. MARCM (ניתוח פסיפס עם ציטוטמרקר סלולרי ressible) שיטה 8 יכול לספק תיוג של מהות כל נוירון ברמת התא הבודדה, אך לא ניתן להשתמש בהצלחה בעובר והזחל מוקדם בגלל התחלופה האיטית של חלבון GAL80.
בהתחשב במגבלות אלה של תיוג גנטי, אנו מאמינים כי הזרקת צבע נוירון הבודדה בעובר דרוזופילה נשארת טכניקה חשובה וראויה ליישום רחב יותר. כדי לקדם מטרה זו, אנו מספקים כאן תיאור מפורט של השיטה. המחשת כוחה מסופקת על ידי החשבון האחרון שלנו על המורפולוגיה של הסט השלם של interneurons בneuromeres בטן של העובר מאוחר תסיסנית 14. מחקר זה, שחשף גם את השונות מורפולוגית של סוגי תאים עצביים בודדים ועקרונות של ארגון neuromere במערכת העצבים המרכזיים של העובר, לא היה אפשרי עם כל שיטת תיוג זמינה אחרת.
אחד יתרונות עיקריים של דרוזופילה כמודל למערכת הוא שהיא מאפשרת ניתוח של התפתחות ותפקוד ברמה של תאים בודדים. זה שימושי במיוחד לגבי מערכת עצבים, שם המגוון של סוגי תאים הוא גבוה במיוחד והתפקוד והמורפולוגיה של תאי שכנים יכולים להיות שונים לחלוטין.
<p class="jove_content" style=…The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מDFG לGMT
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
REAGENTS | |||
DAB | Sigma-Aldrich | D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
DiI | Invitrogen/Molecular Probes | D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
Glycerol | Roth | 3783 | 70% in PBS |
Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
PBS | 1x | ||
TRIS | Roth | 4855 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
EQUIPMENT | |||
Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
DC – amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
Coverslips | Menzel | BB018018A1 | 18 x 18 mm |
Coverslips | Menzel | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
Flat Capillaries | Hilgenberg | outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
Object Slides | Marienfeld Superior | 1000000 | |
Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1.